a, a’: Mật độ nuôi cấy 2g PLBs b, b’: Mật độ nuôi cấy 4g PLBs
3.3.2. Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập lên sự nhân PLB trong hệ thống Plantima.
sự nhân PLB trong hệ thống Plantima.
Sử dụng 6 g PLB nuôi cấy trong bình Plantima có thể tích môi trường là 200 ml, các nghiệm thức về tần suất ngập mẫu ( thời gian ngập mẫu và chu kỳ ngập) được thiết kế và ghi nhận kết quả trong bảng sau
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB
Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số PLB hình thành Số chồi Nhận xét 2giờ/10p hút 50,85 ± 5,31 6276,98 ± 413,26b 125,28 ± 11,65 PLB rất to, xanh tốt 2giờ/5 phút 42,27 ± 6,27 6112,3 ± 326,41b 82,96 ± 6,57 PLB xanh tốt 1giờ/10p hút 68,18 ± 6,96 8545,68 ± 612,45a 187,89 ± 9,60 PLB rất to, một số có dạng trong, mọng nước.
Thời gian ngập và chu kỳ ngập của mẫu cấy trong môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng do nó ảnh hưởng đến sự hấp thu chất dinh dưỡng của mẫu cấy cũng như sự xảy ra hiện tượng thủy tinh thể.
Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB
Trong thí nghiệm này, thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ 1 giờ cho hệ số nhân PLB cao hơn (8545,68 PLB so với 6112,3 và 6276,98 PLB), nhưng PLB chủ yếu ở dạng trong, mọng nước rất khó chuyển sang dạng chồi để phát triển thành cây hoàn chỉnh. Như vậy tần suất ngập chìm cao (1 giờ ngập 1 lần) đã gây ra hiện tượng thủy tinh thể ở PLB.
Tian-Su Zhou (1995) khi khảo sát các yếu tố gây ra hiện tượng thủy
tinh thể ở Lan Hồ Điệp ông thấy rằng các PLB bình thường có nhiều khoảng không chứa khí hơn các PLB thủy tinh thể và ông cũng nhận thấy rằng PLB bị thủy tinh thể cho hiệu suất nhân PLB cao hơn bình thường gấp 2 lần và vấn đề này đến nay vẫn chưa được giải thích rõ ràng. Zhou cho rằng việc mất lignin, cellulose trong PLB bị thủy tinh thể làm yếu mối liên hệ giữa các tế bào trong mô, các tế bào có thể dễ dàng thoát khỏi tương tác ức chế và hình thành nhiều phác thể PLB mới.
Thời gian ngập 5 và 10 phút sau mỗi 2 giờ cho tốc độ nhân PLB là như nhau, số lượng PLB khoảng từ 6100 - 6300 PLB. Cụm PLB thu được xanh mướt và có xuất hiện sự tái sinh chồi. Điều này cho thấy thời gian ngập từ 5-10 phút không ảnh hưởng đến tốc độ nhân PLB mà chủ yếu là số lần bơm môi trường nuôi cấy trong ngày. Thời gian ngập 5 phút với chu kỳ 2 giờ cho chất lượng PLB tốt nhất, chồi xanh tốt phát triển bình thường.
Krueger và cộng sự (1991) đã chứng minh được tầm quan trọng của
tần suất ngập chìm lên hiệu quả nhân chồi ở cây Serviceberry. Khi cho ngập chìm 5 phút với chu kỳ 30 phút cây bị mọng nước, nhưng khi cho ngập 5 phút với chu kỳ 60 phút thì không xảy ra hiện tượng này. Vì vậy trong thí nghiệm về tần suất ngập chìm chúng tôi thấy tần suất ngập 5 phút với chu kỳ 2 giờ thích hợp cho việc nhân nhanh PLB của giống Hồ Điệp này.
Bảng 3.10. So sánh hệ số nhân PLB của các hệ thống nuôi cấy khác nhau Hệ thống nuôi cấy Lượng PLB sử dụng ban đầu (g) Tổng số PLB tạo thành Số PLB tạo ra/ 1PLB ban đầu Lỏng lắc (40 ml) 6,0 5022 8,3 Lỏng tĩnh (20 ml) 6,0 3032 5,05 Plantima 6,0 6112 10,2 Thạch 6,0 2200 3,6
Khi so sánh giữa nhân PLB trên hệ thống Plantima với phương pháp nhân PLB trên môi trường thạch kết quả cho thấy với cùng một lượng PLB ban đầu là 6 g sau thời gian 6 tuần lượng PLB tạo thành trên hệ thống Plantima gấp 2.77 lần lượng PLB tạo thành trên môi trường thạch (6112 PLB trên hệ thống Plantima so với 2200 trên môi trường thạch).Và nuôi cấy
trên hệ thống Plantima cho tỉ lệ nhân PLB gấp 1.2 lần so với nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc và gấp 2 lần trên môi trường lỏng tĩnh.
Sự phát triển và tăng trưởng của mô cấy không chỉ phụ thuộc vào thành phần chất dinh dưỡng mà còn phụ thuộc vào thành phần không khí bên trong các bình nuôi cấy (Ziv, 1991). Điều này được thấy rõ trong hệ thống Plantima với việc ngập chìm theo thời gian và tần xuất tối ưu cho từng đối tượng có tác dụng cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng và sự trao đổi khí nên mẫu cấy phát triển tăng sinh nhanh và tốt hơn mẫu đối chứng trên môi trường thạch. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Park và
cộng sự (2000) khi sử dụng các hệ thống bioreactor khác nhau trong nuôi cấy PLB của Hồ Điệp tác giả ghi nhận rằng với hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời có gắn màng lọc than hoạt tính (charcoal filter) và được lập chương trình cho ngập 5 phút cứ sau mỗi chu kỳ 125 phút nhờ 1 máy hẹn giờ (timer) cho kết quả nhân PLB tốt nhất, từ 20 g PLB ban đầu sau thời gian nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời này cho tạo được 18.000 PLB.
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân nhanh PLBs
a, a’: PLBs được nuôi cấy ở tần suất 1 giờ/ 10 phútb, b’: PLBs được nuôi cấy ở tần suất 2 giờ/ 5 phút b, b’: PLBs được nuôi cấy ở tần suất 2 giờ/ 5 phút c, c’: PLBs được nuôi cấy ở tần suất 2 giờ/ 10 phút