Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-hexan;

Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa bằng phƣơng pháp sắc ký cột.

2.4.2.1.β – Sitosterol (KĐN.H8)

Lấy 62,7g cặn chiết n- hexan đem tách trên cột có đường kính 1,5 cm dài 45 cm, với chất hấp phụ là silicagel khối lượng 100g, có kích thước hạt 60m – 100 m, dung môi rửa giải là n – hexan: etylaxetat với tỷ lệ etylaxetat tăng dần từ 0% - 100%. Các phân đoạn thu được từ cột được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi triển khai là n – hexan: etylaxetat (8: 1), hiện màu bằng thuốc thử vanilin/H₂SO4 10%.

Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa

Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại với nhau và đem cất loại dung môi thu được 8 phân đoạn với nhiều cấu tử khác nhau.

Các phân đoạn từ 1 đến 6 và phân đoạn 7 đều là hỗn hợp, riêng phân đoạn 8 (rửa giải cột bằng hỗn hợp n – hexan: etylaxetat (20: 1)) có Rf C là 32, cất loại dung môi thu khối chất rắn vô định hình màu vàng nhạt, kết tinh lại trong axeton thu được 0,9870g những tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 138-1400 C. KĐN.H 62,7g Silicagel n-Hexan:EtOAc (20:1) KĐN.H8

Phổ FT-IR (KBr): ớmax(cm^-1): 3426 (rộng, mạnh); 2983; 2932; 2868; 1651 (yếu); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]⁺ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1 H-NMR (200MHz, CDCl3,  (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J_28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J_21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J_26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Phổ 13 C -NMR (50MHz, CDCl₃),  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,8 (s, C-5); 121,7 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29).

2.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33).

Lấy 14,8g cặn chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa đem tách trên cột silicagel với khối lượng 70g. Cột có đường kính 2,5 cm, dài 45 cm. Rửa giải cột bằng hỗn hợp dung môi Cloroform: metanol với tỷ lệ metanol tăng dần từ 0 – 100%. hệ dung môi chạy bản mỏng là Cloroform: metanol (5:1). Hiện màu bằng thuốc thử vanilin/ H₂SO₄ 10%, thu được tất cả 33 phân đoạn.

Sơ đồ 2.4 Phân lập chất từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa

Phân đoạn 33 (rửa giải cột bằng cloroform: metanol (95:5)), sau khi cất đuổi dung môi và kết tinh lại trong etylaxetat/metanol, rửa lại bằng axeton thu được 0,007 g khối chất rắn vô định hình, nóng chảy ở 273 - 2750

C, Rf E=35 Phổ 1 H-NMR (CDCl3/MeOD, 500MHz,): (ppm) 0,71 (3H, s, Me-18); 0,77 (3H, s, Me-19); 5,36 (1H, H-6); Phổ 13 C – NMR (125 MHz, DMSO – d6); (ppm): 140,41 (s, C-5) ; 121,12 (d, C-6); 100,76 (d, C-1’); 76,89 (d, C-3’); 76,73(d, C - 5’); 76,69 (d - C3); 73,42 (d, C - 2’); 70,01 (d, C- 4’); 61,06 (t, C - 6’); 56,13 (d, C - 14); 55,39 (d, C-17); 50, 53 ( d, C-9); 49, 56 (d, C- 24); 45, 11 (s, C – 13); 40, 92 (t, C – 4); 39, 76 (t, C- 12); 36, 78 (t, C – 1); 35, 43 (s, C - 10); 33, 31 (d, C- 20); 31, 37 (t, C- 22); 31, 32 (d, C- 8); KĐN.E 14,8g KĐN.E33 Silicagel Clorofom:metanol (95:5)

29, 22 (t,C – 16); 28, 68 (t, C- 23); 27, 73 (t, C- 2); 25, 43 (t, C-25); 23, 80 (t, C- 15);

22, 572 (t, C – 28); 21, 05 (t, C–11); 20,86 (d, C–27); 19, 64 (q, C- 19); 19, 04 (q, C–26); 12, 05 (q,C– 29); 11, 73 (q, C – 18).

CHƢƠNG3

THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG

Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp.

Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau [4].

1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol v.v....

2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol/nước. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau.

Việc chiết mẫu quả Ké đầu ngựa được thực hiện theo phương án 2. (Sơ đồ 2.1).

Các dịch chiết thô đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) giúp cho việc định hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có phản ứng dương tính với các biotest.

Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định cho biết một số dịch chiết có hoạt tính mạnh với vi sinh vật kiểm định.

3.2. PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT

N – HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.)

Việc phát hiện định tính các nhóm chất trong dịch chiết n-hexan và dịch chiết etylaxetat của quả Ké đầu ngựa, được tiến hành thực nghiệm như ở mục 2.3.3. Kết quả thực nghiệm thu được chỉ ra ở bảng 2.3 như sau:

Bảng 2.3 Phát hiện định tính các nhóm chất

STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn KĐN.H KĐN.E KĐN.M 1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + + 2 Sterol Liebermanm-Burchard + + +

3 Flavonoit Xianidin - - -

4 Saponin Tạo bọt - + +

5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - +

6 Tanin FeCl3 5% - - +

7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - -

3.3 KẾT QUẢ THỬ HỌAT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) .

Việc nghiên cứu hoá thực vật của bất kỳ 1 loài thực vật (hay những bài thuốc dân gian) nào thường được bắt đầu bằng việc thử hoạt tính sinh học các loại dịch chiết cô của nó, nhằm định hướng cho việc phân lập các hoạt chất có trong cây.

Các mẫu nghiên cứu được đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) và hoá học đặc hiệu sẽ cho biết chúng có những hoạt tính gì và lớp chất nào có trong thực vật. Kết quả thử hoạt tính sinh học giúp cho việc định

hướng tìm kiếm hoạt chất, lựa chọn các phân đoạn ưu tiên để phân lập và nhận dạng cấu trúc hoá học của hoạt chất.

Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n-hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa được thực hiện tại phòng Thử nghiệm hoạt tính Sinh học-Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. Qui trình thử chúng tôi đã trình bày cụ thể ở mục (2.3.2). Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n – hexan, dịch chiết etylaxetat

và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa.

STT Tên mẫu

Tên chủng vi sinh vật kiểm định

Ec. Escherichia coli IC50g/ml Pa: Pseudomonas aeruginosa IC50g/ml Bs: Bacillus subtilis IC50g/ml Sa: Staphylococcus aureus IC50g/ml Ca: Candida albicans IC50g/ml 01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256

Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy : dịch chiết n - hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa đều cho phản ứng âm tính với các chủng vi khuẩn. Điều này chính tỏ rằng các dịch chiết trên của quả Ké đầu ngựa không có khả năng kháng khuẩn.

Những công trình nghiên cứu trước đây về khả năng kháng khuẩn của dầu béo một số loài thực vật chi Xanthium strumarium L.cho thấy : trong dầu hạt thưc vật thuộc chi Xanthium strumarium L., có khả năng kháng khuẩn khá cao. Vậy sự khác nhau về kết quả nghiên cứu này, phải chăng nguyên nhân là sự khác nhau về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật.

Trong tài liệu mà chúng tôi thu thập được không thấy tài liệu nào nói về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật. Theo chúng tôi, có thể các nhà nghiên cứu trước đã thu nhận dầu béo từ hạt thực vật bằng phương pháp ép trích li từ hạt, khi đó các hợp chất có chứa trong thành phần của hạt, kể cả những chất có hoạt tính và những chất không có hoạt tính, đều được ép ra cùng với dầu. Chính vì vậy hỗn hợp các chất này đã tạo cho dầu béo Quả Ké đầu ngựa thu được bằng phương pháp này có khả năng kháng khuẩn cao.

Còn dầu Quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu được tách ra từ hạt theo phương pháp chiết shoxlet trong các dung môi khác nhau (n-hexan, etylaxetat và metanol) chính vì lẽ đó mà các chất chứa trong dầu béo của quả Ké đầu ngựa được chúng tôi tách chiết ra đã có sự chọn lọc theo độ phân cực tăng dần của dung môi.

Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy không có dịch chiết trong các dung môi n – hexan, etylaxetat, metanol của quả Ké đầu ngựa là có khả năng kháng khuẩn yếu, như vậy chứng tỏ những chất có khả năng kháng khuẩn trong quả Ké đầu ngựa là những chất phân cực. Nhưng trong quá trình chiết quả Ké đầu ngựa chúng tôi mới chỉ dừng lại ở dung môi metanol, nên có thể những chất có độ phân cực cao hơn và có khả năng kháng khuẩn cao chưa được tách ra .

3.4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA.

3.4.1. Các axit béo.

Sắc kí đồ của dầu quả Ké đầu ngựa xem ở phụ lục.

Bằng phương pháp GC chúng tôi đã xác định được, trong quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nghiên cứu có 9 cấu tử, trong đó có 5 cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1%, 4 cấu tử có hàm lượng axit béo dưới 1% và một số cấu tử khác chưa xác định cấu trúc cũng có hàm lượng axit béo dưới 1%.

Bảng 3.1: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo trên 1% trong quả Ké đầu ngựa

TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng ^Thời gian lƣu

Hàm lƣợng

%

1 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28

2 C18:1 (n-9) Axit cis-9-Octadecenoic Oleic 25.72 27.67 3 C18:2 (n-6) Axit 9,12- Octadecadienoic Linoleic 27.90 23.21 4 C18:3 (n-6) Axit 6,9,12- Linolenic Linolenic 28.39 38.60 5 C19:1 (n-9) Axit 10- nonadecaenoic - 28.44 5.24

Bảng 3.2: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo dƣới 1% trong quả Ké đầu ngựa

TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng ^Thời gian lƣu

Hàm lƣợng

%

1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03

2 C15:0 Axit

pentadecanoic

3 C22:5 (n-3) Axit 5,8,11,14,17-

Docosapetaenoic

DPA 53.60 0.24

4 Other 0.84

Trong các cấu tử của quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nhận được qua GC/MS, có 4.2 % cấu tử đã nhận dạng được là các axít béo no, 94.96 % các cấu tử là các axít béo không no.

Các cấu tử chưa nhận dạng được đều là các chất có hàm lượng dưới 1%, chúng đều là những chất chưa có kết luận chắc chắn về cấu trúc phân tử.

Nhìn chung các axit có số nguyên tử cacbon chẵn và nối đôi có cấu hình dạng cis hoặc Z, định vị bắt đầu từ nguyên tử cacbon số 9 kể từ nhóm

cacboxyl hoặc kể từ nhóm metyl (n-9). Đồng phân 9Z được tìm thấy nhiều trong axit hexadecenoic. Nó là một hợp chất có nhiều trong dầu cá và là thành phần chính trong một vài loại dầu hạt.

Axit oleic được phân bố rộng dãi nhất trong tất cả axit béo và đại diện cho axit ở dạng một nối đôi. Axit này có hàm lượng khá cao trong quả Ké đầu ngựa.

Axit linolenic chiếm hàm lượng cao nhất trong quả Ké đầu ngựa, đây là một loại axit có nhiều trong hầu hết dầu hạt thực vật. Ngoài ra, nó có trong lipit động vật và dầu cá ở mức độ thấp. Axit ó – Linolenic (n-6) – 18:3, là bước chuyển hoá trung gian của axit linolenic tới axit archidonic. Các dầu chứa axit này trong Y học được dùng để chữa trị một số bệnh: Eczema, viêm khớp, xơ cứng động mạch, lão hoá.

Dựa vào sắc kí đồ ta thấy:

Thành phần chính của quả Ké đầu ngựa là 6,9,12 - Linolenic axit (chiếm 38.60 %); Cis-7-Octadecenoic axit (chiếm 27,67 %); 9,12-

Octadecadienoic axit (chiếm 23,21 %). Ngoài ra trong thành phần của quả Ké đầu ngựa còn chứa một số axit béo không no khác.

Dưới đây là công thức cấu tạo của chất chính có hàm lượng tương đối cao trong quả Ké đầu ngựa.

o o 9, 12 - octadecadienoic axit (23,21 %) COOH Oleic axit (27,67%) COOH 9,6,12 – Linolenic axit (38,60 %) 3.4.2. Các hợp chất sterol

Những chất có khung steroit được tìm thấy trong các dịch chiết của quả Ké đầu ngựa thường là các sterol C29 với bộ khung 3-ol 5-pregnan hoặc dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau. Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập được, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dưới đây.

Là những tinh thể hình kim không màu cũng thu được từ dịch chiết n- hexan của quả Ké đầu ngựa, điểm nóng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi.

Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nó là 414, từ các phổ FT-IR, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxi (OH) : max = 3426 cm-1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và

C-3 = 71,7 ppm, một nối đôi C=C : max = 1651cm-1 (yếu), H-6 = 5,35 ppm (d), J=5Hz, C-5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm.

Sơ đồ 3.1: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8

HO m/z = 414 HO m/z = 329 ^{m/z = 396} CH2 - H2O - 15 - C4 H8 - C6H13

Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với -sitosterol.

Bảng 3.3: Số liệu phổ ¹³C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của õ-sitosterol

STT -sitosterol ppm 1 37.3 t 2 31.7 t 3 71.8 d 4 42.3 t 5 140.8 s 6 121.7 d 7 31.9 t 8 31.9 d 9 50.2 d 10 36.5 s 11 21.1 t 12 39.8 t 13 42.3 s 14 56.8 d 15 24.3 t m/z = 255

STT -sitosterol ppm 16 28.3 t 17 56.1 d 18 11.9 q 19 19.4 q 20 36.2 d 21 18.8 q 22 33.9 t 23 26.1 t 24 45.9 d 25 29.2 d 26 19.1 q 27 19.4 d 28 23.13 t 29 11.9 q

3.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33)

Chất rắn ở dạng vô định hình, không tan trong cloroform, metanol, dễ tan trong hệ dung môi cloroform / metanol, nóng chảy ở 273- 275⁰C.

Phổ 13

C-NMR quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử cacbon, trong đó có 7 nguyên tử cacbon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,1ppm đến 100,8ppm). Hai tín hiệu ở 140,41 và 121,12ppm thuộc về một liên kết olefin. Phổ 1H- NMR xác nhận sự có mặt của một liên kết đôi ở 5,36 ppm và của nhóm hydroxy ở vùng 3,5ppm đến 4,0 ppm.

Số liệu từ các phổ 1

H- NMR, phổ ¹³C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến cấu trúc của hợp chất glucozit có công thức C₃₅H60O6. Đem chất này thuỷ phân trong axit loãng đã thu được -sitosterol, đồng thời trong phổ cũng thấy mất đi tín hiệu của gốc đường. Điều này cũng chứng tỏ rằng một phân tử đường đã bị loại ra khỏi phân tử -sitosterol glucozit. Các số liệu phổ thực nghiệm thu được so với số liệu phổ chuẩn đã khẳng định chất rắn vô định hình nóng chảy ở 273-2750

C chính là -sitosterol-3-O--D- glucopyranosyl.

14 56,79 (d) 56,75 15 24,32 (t) 24,15 16 28,26 (t) 28,25 17 56,09 (d) 56,02 18 0,6 (3H, s) 11,89 (q) 11,84 19 1,01 (3H, s) 19,41 (q) 19,46 20 36,16 (c) 36,07 21 0,92 (3H, d) 18,80 (q) 18,68

22 . 33,98 (t) 33,95 23 26,13 (t) 26,10 24 45,88 (d) 45,82 25 29,19 (d) 29,05 26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) 19,77 27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) 19,21 28 23,13 ()t 23,13 29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) 11,04 OH * Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13 C – NMR của KĐN.H8 mà chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13

C – NMR của (3, 24R)

 - sitosterol thấy rằng kết quả tơng đối giống nhau. Tuy nhiên một vài số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau.

Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của  - Sitosterol mà dữ liệu phổ đa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau.

Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng phân mảnh của KĐN.H8 có thể xảy ra như sau: