N – HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.)
Việc phát hiện định tính các nhóm chất trong dịch chiết n-hexan và dịch chiết etylaxetat của quả Ké đầu ngựa, được tiến hành thực nghiệm như ở mục 2.3.3. Kết quả thực nghiệm thu được chỉ ra ở bảng 2.3 như sau:
Bảng 2.3 Phát hiện định tính các nhóm chất
STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn KĐN.H KĐN.E KĐN.M 1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + + 2 Sterol Liebermanm-Burchard + + +
3 Flavonoit Xianidin - - -
4 Saponin Tạo bọt - + +
5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - +
6 Tanin FeCl3 5% - - +
7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - -
3.3 KẾT QUẢ THỬ HỌAT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) .
Việc nghiên cứu hoá thực vật của bất kỳ 1 loài thực vật (hay những bài thuốc dân gian) nào thường được bắt đầu bằng việc thử hoạt tính sinh học các loại dịch chiết cô của nó, nhằm định hướng cho việc phân lập các hoạt chất có trong cây.
Các mẫu nghiên cứu được đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) và hoá học đặc hiệu sẽ cho biết chúng có những hoạt tính gì và lớp chất nào có trong thực vật. Kết quả thử hoạt tính sinh học giúp cho việc định
hướng tìm kiếm hoạt chất, lựa chọn các phân đoạn ưu tiên để phân lập và nhận dạng cấu trúc hoá học của hoạt chất.
Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n-hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa được thực hiện tại phòng Thử nghiệm hoạt tính Sinh học-Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. Qui trình thử chúng tôi đã trình bày cụ thể ở mục (2.3.2). Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n – hexan, dịch chiết etylaxetat
và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa.
STT Tên mẫu
Tên chủng vi sinh vật kiểm định
Ec. Escherichia coli IC50g/ml Pa: Pseudomonas aeruginosa IC50g/ml Bs: Bacillus subtilis IC50g/ml Sa: Staphylococcus aureus IC50g/ml Ca: Candida albicans IC50g/ml 01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy : dịch chiết n - hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa đều cho phản ứng âm tính với các chủng vi khuẩn. Điều này chính tỏ rằng các dịch chiết trên của quả Ké đầu ngựa không có khả năng kháng khuẩn.
Những công trình nghiên cứu trước đây về khả năng kháng khuẩn của dầu béo một số loài thực vật chi Xanthium strumarium L.cho thấy : trong dầu hạt thưc vật thuộc chi Xanthium strumarium L., có khả năng kháng khuẩn khá cao. Vậy sự khác nhau về kết quả nghiên cứu này, phải chăng nguyên nhân là sự khác nhau về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật.
Trong tài liệu mà chúng tôi thu thập được không thấy tài liệu nào nói về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật. Theo chúng tôi, có thể các nhà nghiên cứu trước đã thu nhận dầu béo từ hạt thực vật bằng phương pháp ép trích li từ hạt, khi đó các hợp chất có chứa trong thành phần của hạt, kể cả những chất có hoạt tính và những chất không có hoạt tính, đều được ép ra cùng với dầu. Chính vì vậy hỗn hợp các chất này đã tạo cho dầu béo Quả Ké đầu ngựa thu được bằng phương pháp này có khả năng kháng khuẩn cao.
Còn dầu Quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu được tách ra từ hạt theo phương pháp chiết shoxlet trong các dung môi khác nhau (n-hexan, etylaxetat và metanol) chính vì lẽ đó mà các chất chứa trong dầu béo của quả Ké đầu ngựa được chúng tôi tách chiết ra đã có sự chọn lọc theo độ phân cực tăng dần của dung môi.
Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy không có dịch chiết trong các dung môi n – hexan, etylaxetat, metanol của quả Ké đầu ngựa là có khả năng kháng khuẩn yếu, như vậy chứng tỏ những chất có khả năng kháng khuẩn trong quả Ké đầu ngựa là những chất phân cực. Nhưng trong quá trình chiết quả Ké đầu ngựa chúng tôi mới chỉ dừng lại ở dung môi metanol, nên có thể những chất có độ phân cực cao hơn và có khả năng kháng khuẩn cao chưa được tách ra .
3.4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA.
3.4.1. Các axit béo.
Sắc kí đồ của dầu quả Ké đầu ngựa xem ở phụ lục.
Bằng phương pháp GC chúng tôi đã xác định được, trong quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nghiên cứu có 9 cấu tử, trong đó có 5 cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1%, 4 cấu tử có hàm lượng axit béo dưới 1% và một số cấu tử khác chưa xác định cấu trúc cũng có hàm lượng axit béo dưới 1%.
Bảng 3.1: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo trên 1% trong quả Ké đầu ngựa
TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu
Hàm
lƣợng
%
1 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28
2 C18:1 (n-9) Axit cis-9-Octadecenoic Oleic 25.72 27.67 3 C18:2 (n-6) Axit 9,12- Octadecadienoic Linoleic 27.90 23.21 4 C18:3 (n-6) Axit 6,9,12- Linolenic Linolenic 28.39 38.60 5 C19:1 (n-9) Axit 10- nonadecaenoic - 28.44 5.24
Bảng 3.2: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo dƣới 1% trong quả Ké đầu ngựa
TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu
Hàm lƣợng
%
1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03
2 C15:0 Axit
pentadecanoic
3 C22:5 (n-3) Axit 5,8,11,14,17-
Docosapetaenoic
DPA 53.60 0.24
4 Other 0.84
Trong các cấu tử của quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nhận được qua GC/MS, có 4.2 % cấu tử đã nhận dạng được là các axít béo no, 94.96 % các cấu tử là các axít béo không no.
Các cấu tử chưa nhận dạng được đều là các chất có hàm lượng dưới 1%, chúng đều là những chất chưa có kết luận chắc chắn về cấu trúc phân tử.
Nhìn chung các axit có số nguyên tử cacbon chẵn và nối đôi có cấu hình dạng cis hoặc Z, định vị bắt đầu từ nguyên tử cacbon số 9 kể từ nhóm
cacboxyl hoặc kể từ nhóm metyl (n-9). Đồng phân 9Z được tìm thấy nhiều trong axit hexadecenoic. Nó là một hợp chất có nhiều trong dầu cá và là thành phần chính trong một vài loại dầu hạt.
Axit oleic được phân bố rộng dãi nhất trong tất cả axit béo và đại diện cho axit ở dạng một nối đôi. Axit này có hàm lượng khá cao trong quả Ké đầu ngựa.
Axit linolenic chiếm hàm lượng cao nhất trong quả Ké đầu ngựa, đây là một loại axit có nhiều trong hầu hết dầu hạt thực vật. Ngoài ra, nó có trong lipit động vật và dầu cá ở mức độ thấp. Axit ó – Linolenic (n-6) – 18:3, là bước chuyển hoá trung gian của axit linolenic tới axit archidonic. Các dầu chứa axit này trong Y học được dùng để chữa trị một số bệnh: Eczema, viêm khớp, xơ cứng động mạch, lão hoá.
Dựa vào sắc kí đồ ta thấy:
Thành phần chính của quả Ké đầu ngựa là 6,9,12 - Linolenic axit (chiếm 38.60 %); Cis-7-Octadecenoic axit (chiếm 27,67 %); 9,12-
Octadecadienoic axit (chiếm 23,21 %). Ngoài ra trong thành phần của quả Ké đầu ngựa còn chứa một số axit béo không no khác.
Dưới đây là công thức cấu tạo của chất chính có hàm lượng tương đối cao trong quả Ké đầu ngựa.
o o 9, 12 - octadecadienoic axit (23,21 %) COOH Oleic axit (27,67%) COOH 9,6,12 – Linolenic axit (38,60 %) 3.4.2. Các hợp chất sterol
Những chất có khung steroit được tìm thấy trong các dịch chiết của quả Ké đầu ngựa thường là các sterol C29 với bộ khung 3-ol 5-pregnan hoặc dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau. Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập được, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dưới đây.
Là những tinh thể hình kim không màu cũng thu được từ dịch chiết n- hexan của quả Ké đầu ngựa, điểm nóng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi.
Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nó là 414, từ các phổ FT-IR, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxi (OH) : max = 3426 cm-1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và
C-3 = 71,7 ppm, một nối đôi C=C : max = 1651cm-1 (yếu), H-6 = 5,35 ppm (d), J=5Hz, C-5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm.
Sơ đồ 3.1: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8
HO m/z = 414 HO m/z = 329 m/z = 396 CH2 - H2O - 15 - C4 H8 - C6H13
Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với -sitosterol.
Bảng 3.3: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của õ-sitosterol
STT -sitosterol ppm 1 37.3 t 2 31.7 t 3 71.8 d 4 42.3 t 5 140.8 s 6 121.7 d 7 31.9 t 8 31.9 d 9 50.2 d 10 36.5 s 11 21.1 t 12 39.8 t 13 42.3 s 14 56.8 d 15 24.3 t m/z = 255
STT -sitosterol ppm 16 28.3 t 17 56.1 d 18 11.9 q 19 19.4 q 20 36.2 d 21 18.8 q 22 33.9 t 23 26.1 t 24 45.9 d 25 29.2 d 26 19.1 q 27 19.4 d 28 23.13 t 29 11.9 q
3.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33)
Chất rắn ở dạng vô định hình, không tan trong cloroform, metanol, dễ tan trong hệ dung môi cloroform / metanol, nóng chảy ở 273- 2750C.
Phổ 13
C-NMR quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử cacbon, trong đó có 7 nguyên tử cacbon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,1ppm đến 100,8ppm). Hai tín hiệu ở 140,41 và 121,12ppm thuộc về một liên kết olefin. Phổ 1H- NMR xác nhận sự có mặt của một liên kết đôi ở 5,36 ppm và của nhóm hydroxy ở vùng 3,5ppm đến 4,0 ppm.
Số liệu từ các phổ 1
H- NMR, phổ 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến cấu trúc của hợp chất glucozit có công thức C35H60O6. Đem chất này thuỷ phân trong axit loãng đã thu được -sitosterol, đồng thời trong phổ cũng thấy mất đi tín hiệu của gốc đường. Điều này cũng chứng tỏ rằng một phân tử đường đã bị loại ra khỏi phân tử -sitosterol glucozit. Các số liệu phổ thực nghiệm thu được so với số liệu phổ chuẩn đã khẳng định chất rắn vô định hình nóng chảy ở 273-2750
C chính là -sitosterol-3-O--D- glucopyranosyl.
14 56,79 (d) 56,75 15 24,32 (t) 24,15 16 28,26 (t) 28,25 17 56,09 (d) 56,02 18 0,6 (3H, s) 11,89 (q) 11,84 19 1,01 (3H, s) 19,41 (q) 19,46 20 36,16 (c) 36,07 21 0,92 (3H, d) 18,80 (q) 18,68
22 . 33,98 (t) 33,95 23 26,13 (t) 26,10 24 45,88 (d) 45,82 25 29,19 (d) 29,05 26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) 19,77 27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) 19,21 28 23,13 ()t 23,13 29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) 11,04 OH * Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13 C – NMR của KĐN.H8 mà chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13
C – NMR của (3, 24R)
- sitosterol thấy rằng kết quả tơng đối giống nhau. Tuy nhiên một vài số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau.
Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của - Sitosterol mà dữ liệu phổ đa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau.
Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng phân mảnh của KĐN.H8 có thể xảy ra như sau:
Sơ đồ 3: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8 HO m/z = 414 m/z = 329 m/z = 396 CH2 - H2O - C6H13
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 19 11 12 18 14 13 17 16 15 20 21 23 22 24 25 26 27 28 * Tóm lại : Qua việc phân tích các số liệu phổ, kết hợp với các đặc trưng vật lý, các tài liệu, một lần nữa chúng tôi khẳng định rằng chất KĐN.H8 mà chúng tôi phân lập được là (3, 24 R) - sitosterol có công thức phân tử là C29 H50 O, và có công thức cấu tạo nhưđã trình bày ở trên.
3.4.2.2. - Sitosterol glucosid ( - Sitosterol –3 – o - - D - Glucopyranosyl).
- Chất rắn vô định hình không màu (KĐN.E33) không tan trong cloroform, axeton dễ tan trong metanol. to
nc = 282 – 283. Rf = 35. Phổ FT – I R (viên nén KBr) có các vân hấp thụ đặc trưng sau
m/z = 255
3390 cm-1 (mạnh, rộng) ứng với dao động hoá trị của nhóm hiđroxyl (- OH)
2934, 2960 cm-1 (mạnh) CH ứng với dao động hoá trị của các nhóm – CH3 và > CH2 no.
1640 cm-1 (yếu) C = C ứng với dao động hoá trị > C = C < an ken 1461 cm-1 (trung bình) CH ứng với dao động biến dạng của các nhóm > CH2 và - CH3
1373 cm-1 (trung bình) CH3 ứng với dao động biến dạng mới xứng của nhóm – CH3 (xem phụ lục).
- Phổ 1H – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: 3,648 (1H, m, - CH – OH); 5,330 (1H, t, > CH -).
- Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều
nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome”
(H–1’) của hexosa xuất hiện dưới dạng doublet tại 4,32 ppm, có J = 7,8 Hz,
và c – 1’ tương ứng là 100,8 ppm.
- Phổ 13C – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: có hai tín hiệu ở 140, 56 (s, C - 5) và 121,33 (d, C – 6) thuộc về một liên kết olephin.
- Ngoài ra với các kỹ thuật khác nhau của 13C – NMR đã quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử các bon, trong đó có 7 nguyên tử các bon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,20 – 100,8 ppm)
- Từ số liệu của các phổ IR, MS, 1H và 13C – NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến của 1 hợp chất glucozit có công thức phân tử C35 H60 O6. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được - sitosterol đồng thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác nhận một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit.
- Từ những dữ kiện trên và đem tiến hành đo điểm nóng chảy với hỗn hợp chất mẫu, thấy không có sự thay đổi, đã cho phép khẳng định chất (KĐN.E33) đã thu được từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa là - sitosterol – 3 – O - - D – glucopyranosyl. 31,69 (t) CH2 31,63 71,84 (d) CH 71,73 42,29 (t) CH2 42,20 140,78 (s) C 140,71 121,74 (d) CH 121,63 31,94 (t) CH2 31,90 31,95 (d) CH 31,81 50,17 (d) CH 51,13 36,53 (s) C 36,43 21,11 (t) CH2 21,09 39,81 (t) CH2 39,79 42,33 (s) C 42,37 56,79 (d) CH 56,75 24,32 (t) CH2 24,15 28,26 (t) CH2 28,25 56,09 (d) CH 56,02
11,89 (q) CH3 11,84 19,41 (q) CH3 19,46 36,16 (c) CH 36,07 18,80 (q) CH3 18,68 33,98 (t) CH2 33,95 26,13 (t) CH2 26,10 45,88 (d) CH 45,82 29,19 (d) CH 29,05 26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) CH3 19,77 27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) CH3 19,21 28 23,13 ()t CH2 23,13 29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) CH3 11,04 OH * Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13 C – NMR của BĐQ mà chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13
C – NMR của (3, 24R)
- sitosterol thấy rằng kết quả tương đối giống nhau. Tuy nhiên một vài số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau.
Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của - Sitosterol mà dữ liệu phổ đưa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau.
Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng phân mảnh của BĐQ có thể xảy ra như sau.
Sơ đồ 3: Sự phân mảnh EI – MS của chất BĐQ
