Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung siêu âm, vi sóng.... nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:
- Tăng nồng độ lên nhiều lần. - Lượng mẫu không cần nhiều. - Lượng dung môi cần ít.
- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu. - Đơn giản, nhanh, giá thành thấp.
Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian... mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất.
1.7.1. Chiết lỏng - lỏng:
Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao.
Quá trình chiết lỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một hằng số.
[A]hc
KA= (0.9) [A]n
KA : hằng số phân bố
[Ahc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ. [An]: nồng độ của chất A trong pha nước.
1.7.2. Chiết pha rắn SPE:
Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu).
Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực phẩm.
Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:
Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp.
Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu.
Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút.
Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.
Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút.
Qua các phân tích nêu trên, ta thấy việc kiểm soát độc tố gây mất trí nhớ ASP (axít domoic) trong thủy sản nói chung và nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là cần thiết. Vì vậy việc nghiên cứu xây dựng một quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS là cần thiết đáp ứng được yêu cầu kiểm soát an toàn thực phẩm của Việt Nam cũng như các thị trường nhập khẩu trên thế giới.
Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS .
- Khảo sát các thông số xác định giá trị sử dụng của phương pháp (giới hạn phát hiện, độ thu hồi, độ lặp lại, và so sánh kết quả phân tích trên LC- MS/MS với phương pháp HPLC-UV).
- Thu thập và phân tích một số mẫu nhuyễn thể 2 mảnh vỏ (NT2MV) tại một số vùng thu hoạch NT2MV ở 12 vùng thu hoạch NT2MV tại Việt Nam.
2.2. Mô hình thực nghiệm
Tiến hành thực nghiệm theo mô hình dưới đây (Hình 1):
Hình 14. Mô hình thực nghiệm 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: Chọn dung môi chiết Chọn phương pháp chiết Chọn các thông số LC, MS/MS Chọn thành phần pha động, gradient Xây dựng qui trình chạy mẫu Xây dựng qui trình chiết mẫu Xây dựng phương pháp Kiểm tra độ lặp lại Kiểm tra độ thu hồi Tìm giới hạn phát hiện Xác định độ đặc hiệu Phân tích một số mẫu thật
2.3.1.2. Cột sắc ký lỏng C8 kích thước cột 4,6x150mm kích thước hạt 5µm (Merck- Licrocart 150-4 RP-8), Đức.
2.3.1.3. Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Quốc. 2.3.1.4. Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), Mỹ .
2.3.1.5. Bểđánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ. 2.3.1.6. Cân kỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức. 2.3.1.7. Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức. 2.3.1.8. Máy lắc mẫu (IKA KS-260), Đức. 2.3.1.9. Transferpette 1ml (Eppendorf). 2.3.1.10.Ống ly tâm 50ml. 2.3.1.11.Màng lọc mẫu 0.45μm, φ: 25mm. 2.3.1.12.Ống tiêm nhựa loại 5ml. 2.3.1.13.Giấy lọc. 2.3.1.14.Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu; cốc có mỏ,...
2.3.1.15.Hệ thống LC-MS/MS, model Micromass API, hãng Waters – Mỹ 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất:
Tất cả các thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích
2.3.2.1. Chuẩn axít domoic (Sigma). Bảo quản chuẩn rắn trong ngăn đông tủ lạnh.
2.3.2.2. Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước HPLC), Merck – Đức. 2.3.2.3. Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC, Merck – Đức.
2.3.2.4. Axít Trifluoroacetic TFA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức. 2.3.2.5. Axít Formic(FA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức.
Cách thức pha hóa chất, chất chuẩn được thực hiện theo mục 3.7
2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:
Tiến hành thu thập 36 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại 12 vùng thu hoạch trong cả nước, chi tiết theo tại Bảng 02:
Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm
TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu
1. Nghêu Bến Tre 03 Giao Thủy – Nam Định 20/7; 18/8; 09/11 2. Nghêu Bến Tre 03 Tiền Hải – Thái Bình 20/7; 18/8; 09/11
TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu
4. Điệp 03 Phan Thiết – Bình Thuận 28/7; 18/8;
10/11
5. Sò anti 03 Tuy Phong – Bình Thuận 28/7; 18/8;
10/11
6. Nghêu Bến Tre 03 Bình Đại – Bến Tre 28/7; 18/8;
10/11
7. Nghêu Bến Tre 03 Ba Tri – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11
8. Sò huyết 03 Thạnh Phú – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11
9. Nghêu Bến Tre 03 Cần Giờ - Hồ Chí Minh 28/7; 18/8; 10/11 10. Nghêu Bến Tre 03 Tân Thành – Tiền Giang 28/7; 18/8; 10/11
11. Sò Lông 03 Bà Lụa – Kiên Giang 20/7; 17/8; 09/11
12. Nghêu lụa 03 Hiệp Thạnh – Trà Vinh 20/7; 17/8; 09/11 Tất cả các mẫu được bảo quản đông ít nhất ở -20oC cho đến khi xử lý.
2.5. Xác định các thông số tối ưu:
2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS
Chúng ta cần tối ưu một số thông số sau: Capillary, Cone volte, Collision energy: thay đổi lần lượt từng thông số trên, nguyên tắc chọn điều kiện tối ưu cho từng thông số như sau:
- Capillary (điện thế mao quản) và Cone Volte (điện thế cone): tại giá trị mà cường độ pic của ion sơ cấp (ion mẹ) là lớn nhất.
- Collision energy (năng lượng va chạm): tại giá trị ứng với cường độ Pic của mỗi mảnh là lớn nhất. Mỗi một Ion con sẽ có một giá trị Collision energy tối ưu tương ứng.
2.5.2. Cột:
5µm. Cột được chọn phải là cột có khả năng phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài.
2.5.3. Pha động và chế độ gradient:
Thay đổi và tối ưu thành phần pha động với mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn bằng cách thay đổi thành phần và tỷ lệ pha động: thực hiện phân tích mẫu thêm chuẩn lần lượt với pha động. Chúng tôi lựa chọn, nghiên cứu 02 pha động sau:
- Pha động 1: 0,1% FA trong H20 (A), 0.1%FA trong ACN
- Pha động 2: 0.05% TFA trong H2O (A), 0,05% TFA trong ACN (B). Pha động được chọn phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài.
2.5.4. Dung môi chiết:
Sau khi chọn được cột tách và thành phần pha động phù hợp, sử dụng phương pháp chiết là chiết lỏng – lỏng với 03 loại dung môi:
- Dung môi 1: MeOH:H20: 1:1
- Dung môi 2: Axít Formic: metanol:H2O: 2:5:93