2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS
Chúng ta cần tối ưu một số thông số sau: Capillary, Cone volte, Collision energy: thay đổi lần lượt từng thông số trên, nguyên tắc chọn điều kiện tối ưu cho từng thông số như sau:
- Capillary (điện thế mao quản) và Cone Volte (điện thế cone): tại giá trị mà cường độ pic của ion sơ cấp (ion mẹ) là lớn nhất.
- Collision energy (năng lượng va chạm): tại giá trị ứng với cường độ Pic của mỗi mảnh là lớn nhất. Mỗi một Ion con sẽ có một giá trị Collision energy tối ưu tương ứng.
2.5.2. Cột:
5µm. Cột được chọn phải là cột có khả năng phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài.
2.5.3. Pha động và chế độ gradient:
Thay đổi và tối ưu thành phần pha động với mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn bằng cách thay đổi thành phần và tỷ lệ pha động: thực hiện phân tích mẫu thêm chuẩn lần lượt với pha động. Chúng tôi lựa chọn, nghiên cứu 02 pha động sau:
- Pha động 1: 0,1% FA trong H20 (A), 0.1%FA trong ACN
- Pha động 2: 0.05% TFA trong H2O (A), 0,05% TFA trong ACN (B). Pha động được chọn phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài.
2.5.4. Dung môi chiết:
Sau khi chọn được cột tách và thành phần pha động phù hợp, sử dụng phương pháp chiết là chiết lỏng – lỏng với 03 loại dung môi:
- Dung môi 1: MeOH:H20: 1:1
- Dung môi 2: Axít Formic: metanol:H2O: 2:5:93 - Dung môi 3: MeOH: H2O: 2:1.
Quy trình chiết: Cân chính xác 2,0 g (m) mẫu đã đồng hóa trên cân kỹ thuật vào ống ly tâm. Thêm chính xác 8,0 ml dung môi chiết mẫu. Lắc mẫu trong vòng 20 phút trên máy lắc mẫu. Ly tâm ở 4500 vòng/ phút trong vòng 10 phút trên máy ly tâm. Lọc dịch trong qua màng lọc mẫu 0,45μm vào lọ thủy tinh vial 1,5 ml.
Sau khi có kết quả, phương pháp được chọn phải là phương pháp loại đáng kể nhiễu nền có thể gây ảnh hưởng đến pic DA đồng thời độ thu hồi tốt. Nếu cả hai tiêu chí trên đều đạt thì chọn lựa phương pháp đơn giản, giá thành thấp và phù hợp với điều kiện ở thực tế.
Thiết lập bảng mẫu với thứ tự sau: - Mẫu chạy thử (pre-test). - 5 mẫu chuẩn sắp xếp từ nhỏ đến lớn. - Mẫu trắng và mẫu kiểm soát. - Các mẫu thử nghiệm. - Mẫu chuẩn Chương trình chạy rửa cột (50% MeOH:50%H2O, 1mL/phút, 50 phút) 2.5.6. Tính toán : Việc tính toán kết quả bằng phần mềm trên hệ thống xử lý dữ liệu – Masslynx 4.0. Dựa vào thời gian lưu của mẫu chuẩn, lập đường cong chuẩn tuyến tính dựa trên diện tích pic và nồng độ của các mẫu chuẩn sau đó mẫu được tính theo đường hồi quy y=ax+b (xi = (yi-b)/a) với y là diện tích pic của mẫu còn x là nồng độ.
Mẫu trắng, mẫu kiểm soát được dùng để tính toán độ thu hồi của mỗi đợt kiểm và xây dựng giản đồ kiểm soát.
Sau khi xác định được các thông số tối ưu, tiến hành xác định khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện của phương pháp, độ lặp lại, độ thu hồi.
2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính:
Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, thực hiện chạy dãy chuẩn với 5 nồng độ pha từ 0,5 ppm đến 30 ppm trong 3 ngày liên tục. Nếu đồ thị tuyến tính trong khoảng nồng độ này (R2 >= 0,99) thì chấp nhận dãy nồng độ này, nếu không phải tiếp tục thu hẹp dải nồng độ cho đến khi nào R2 ≥ 0,99.
2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp:
- Trong trường hợp khi tiến hành phân tích mẫu trắng mà có pic tại thời gian lưu hoặc trong vùng lân cận thời gian lưu của pic DA thì tiến hành xác định độ nhạy của phương pháp bằng cách dùng dãy mẫu thêm chuẩn (spike)
nhỏ nhất trong dãy chuẩn có diện tích pic trung bình cao gấp 10 lần dịên tích pic của mẫu trắng.
- Trong trường hợp mẫu trắng không có pic tại vùng lân cận thời gian lưu của pic DA thì tiến hành xác định độ nhạy của phương pháp bằng cách dùng dãy mẫu thêm chuẩn (spike) giảm dần với nồmg độ để phân tích trong 3 ngày và kiểm tra độ nhạy của pic thông qua tính năng signal-to-noise ratio của chương trình. Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có tỷ lệ pic:nhiễu trung bình của pic DA ít nhất gấp 3 lần so với nhiễu nền. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có tỷ lệ pic:nhiễu trung bình của pic gấp 10 lần so với nhiễu nền.
2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp:
Để thử nghiệm độ lặp lại của phương pháp, tiến hành phân tích trong 3 ngày, mỗi ngày 7 mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn DA 2ppm. Tính toán độ lặp lại của kết quả kết quả thu được thông qua độ lệch chuẩnSr :
1 n d 1 n ) X X ( S 2 2 i r − = − − = ∑ ∑ (0.1) Trong đó: Sr = độ lặp lại Std: độ lệch chuẩn
xi : kết quả thu được trên mẫu thứ i 2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp:
Để thử nghiệm độ thu hồi của phương pháp, chúng tôi tiến hành phân tích trong 3 ngày, mỗi ngày 7 mẫu trắng là nhuyễn thể và 7 mẫu thêm chuẩn DA 2ppm. Tính toán kết quả thu được như sau:
spike uns m C C C R − = (0.2) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó: ⎯Rm : độ thu hồi trung bình
⎯C : giá trị trung bình của các kết quả kiểm nghiệm, được
XSpike : nồng độ của dung dịch mẫu thêm chuẩn. 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể.
Tiến hành kiểm nghiệm 36 mẫu thử đã đề cập ở Bảng 01. Quy trình xử lý mẫu thực hiện giống như trong mục 2.5.4. Sau khi có kết quả, tiến hành lấy ngẫu nhiên một số mẫu đem đi phân tích và so sánh kết quả với phương pháp phân tích DA bằng HPLC-UV để đánh giá độ tin cậy của phương pháp đối với mẫu thật cũng như các thông số liên quan khác.
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xác định các thông số tối ưu:
Để tối ưu hóa một quy trình phân tích DA trên thiết bị LC-MS/MS, chúng ta cần tối ưu 03 công đoạn: (i) các thông số cho đầu dò MS/MS, (ii) các thông số cho sắc ký lỏng, (iii) điều kiện tách chiết.
3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS
Chúng ta cần lựa chọn được các thông số để tối ưu ion mẹ bao gồm hiệu điện thế mao quản (capillary) và hiệu điện thế cone (cone volt); tối ưu ion con bằng cách tối ưu giá trị năng lượng va chạm (collision energy). Dưới đây chúng tôi lần lượt tối ưu từn thông sô:
3.1.1.1. Capillary (hiệu điện thế mao quản): tiêm chuẩn DA thẳng vào đầu dò MS/MS và thay đổi các thông số về Capillary từ nhỏ tới lớn (cố định giá trị của các thông số khác) và chọn giá trị tối ưu capillary ứng với kết quả cường độ tín hiệu của ion [M+H]+ thu được là lớn nhất.
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 03 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 1 – Phụ lục 2). Qua bảng 03 ta thấy giá trị hiệu điện thế mao quản ở giá 2 kV là tối ưu nhất do thu được cường độ tín hiệu lớn nhất:
Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản
STT Capillary Cường độ tín hiệu
1. 1 kV 2,93 e5
2. 2 kV 1,00 e6
3. 3 kV 8,13 e5
Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV
3.1.1.2. Hiệu điện thế cone: tương tự như phần tối ưu thông số Capillary, điều chỉnh cone volt sao cho cường độ tín hiệu của ion mẹ 312 lớn nhất. Kết quả khảo sát điện thế cone và giá trị tối ưu hiệu điện thế cone được trình bày ở Bảng 04 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 2 – Phụ lục 2). Qua Bảng 04 ta thấy tại giá trị cone volt 30 eV là giá trị tối ưu do thu được cường độ tín hiệu là lớn nhất.
Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone
STT Cone volt Cường độ tín hiệu
1. 10 V 9,74 e4
2. 20 V 4,78 e5
3. 30 V 4,89 e5
4. 40 V 1,36 e5
Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V 3.1.1.3. Năng lượng va chạm
Chạy ở chếđộ Full-scan của chếđộ ESI (+) đối với ion phân tử [M+H+], đối với DA có m/z = 312: Thay đổi các giá trị năng lượng va chạm, chọn mảnh ion con và giá trị năng lượng va chạm tương ứng với giá trị mà cường độ của Ion con là lớn nhất.