3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa
Thực hiện các phản ứng sinh hóa sau để khẳng định
Phản ứng lecithinase (-), maltose (-), khử nitrate (+), khử citrate (+), khả năng phân giải tinh bột (+), phản ứng VP (+), catalase (+) kết quả quả thử sinh hóa đƣợc đối
chứng với chủng Bacillus subtilis đối chứng dƣơng của phòng thí nghiệm đƣợc gọi là
chủng số 1 trong các thí nghiệm bên dƣới.
3.3.3 Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng thạch
Cấy E. coli và những chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc vào riêng mỗi ống
nghiệm chứa 5ml môi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, thử đối kháng của Bacillus
1
, 10-2, 10-3, sau đó trang dung dịch vi khuẩn E. coli của từng độ pha loãng lên bề mặt đĩa petri chứa 15 ml môi trƣờng TSA, dùng que cấy vòng lấy 1 vòng canh khuẩn trong ống canh khuẩn Bacillus subtilis cấy thành đốm trên đĩa petri, ủ 37°C trong 24 giờ, dùng compa để đo vòng kháng khuẩn, vòng kháng khuẩn đƣợc tính bằng hiệu số giữa đƣờng kính vòng kháng khuẩn với đƣờng kính khuẩn lạc, chọn 5 chủng cho vòng kháng khuẩn lớn nhất để thực hiện đối kháng trên môi trƣờng TSB.
3.3.4 Đánh giá sự đối kháng với E. coli trong môi trƣờng TSB
Cấy E. coli và chủng vi khuẩn Bacillus subtilis vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, lấy 0,5 ml canh khuẩn của từng chủng
Bacillus subtilis cho vào mỗi bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng TSB, sau đó cho vào mỗi bình tam giác 0,5ml canh khuẩn E. coli. Đánh giá số lƣợng vi khuẩn E. coli ở khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ bằng phƣơng pháp trang đĩa trên môi trƣờng TSA.
Đối chứng âm đƣợc thiết kế bằng cách cho 0,5 ml canh khuẩn E. coli vào bình
tam giác chứa 50 ml môi trƣờng TSB.
3.3.5 Thử kháng sinh đồ
Nuôi cấy trong ồng TSB 5ml trong 24 giờ ở 37°C, pha loãng để đƣợc nồng độ vi khuẩn ở nồng độ tƣơng ứng với ống McFarland tiêu chuẩn 0.5 dùng tăm bông vô trùng trãi đều vi khuẩn trên đĩa petri chứa 15 ml môi trƣờng TSA, đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh trên bề mặt thạch, ủ ở 37°C trong 24 giờ, đo vòng kháng khuẩn so sánh với chuẩn của từng loại kháng sinh.
Kháng sinh đƣợc sử dụng: gentamycin, ciprofoxacin, amoxicillin, colistin, norfloxacin, kanamicin, amox\cla.acid.
3.3.6 Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% 1%
Đổ 15 ml môi trƣờng tinh bột 1% vào đĩa petri, sử dụng que cấy, cấy các chủng
Bacillus subtilis phân lập đƣợc ủ ở 37°C trong 24 giờ, nhỏ dung dịch iod dùng compa đo vòng phân giải tinh bột, tính vòng phân giải là hiệu số giữa đƣờng kính vòng phân giải và đƣờng kính khuẩn lạc.
6. Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết Quả 4.1 Kết Quả
4.1.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo
Phân heo đƣợc pha loãng ở nồng độ 10-2
nung ở 80oC trong 1 giờ, pha loãng ra 10-3, rồi trang trên môi trƣờng TSA kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.1, bắt khuẩn lạc đặc trƣng, khuẩn lạc đặc trƣng của Bacillus subtilis là khuẩn lạc khô rìa nhăn, nằm sát bề mặt thạch.
Hình 4.1: Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA
Các khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc giữ giống, nhuộm gram, thử sinh hóa. Kết quả thu đƣợc 35 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có kết quả thử sinh hóa là:
Phản ứng lecithinase (-) Phản ứng khử nitrate (+) Phản ứng khử citrate (+) Sử dụng maltose (-) Phản ứng catalase (+) Phản ứng VP (+)
Phát triển trong điều kiện yếm khí (+)
Tất cả các chủng này đƣợc thử đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo
4.1.2 Kết quả đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA
Chúng tôi thực hiện thử đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli ở những nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli khác nhau: không pha loãng, 10-1, 10-2, 10-3. Khi không pha loãng canh khuẩn E. coli hoặc độ pha loãng là 10-1 thì không chủng nào tạo
đƣợc vòng kháng khuẩn, ở nồng độ pha loãng 10-2
của canh khuẩn E. coli thì có tất cả 13 chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 4.1, ở nồng độ pha loãng 10-3 thì không thấy tạo vòng kháng khuẩn.
Khi không pha loãng canh khuẩn hoặc ở độ pha loãng 10-1
thì nồng độ E. coli
quá cao nên có thể chịu đựng đƣợc sự tác động của kháng sinh do Bacillus subtilis tiết ra hoặc có một cơ chế nào đó ức chế sự tổng hợp và phân tiết cuả kháng sinh, ở nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2 đó là nồng độ phù hợp cho sự tổng hợp và phân tiết kháng sinh ức chế E. coli của Bacillus subtilis nên tạo đƣợc vòng kháng khuẩn rõ ràng đƣợc thể hiện ở Hình 4.2. Ở nồng độ pha loãng 10-3 không có chủng nào tạo vòng kháng khuẩn, có thể nồng độ E. coli không đủ lớn để khích thích Bacillus subtilis tổng hợp kháng sinh. Có thể sự tổng hợp kháng sinh ức chế vi khuẩn E. coli
gây bệnh tiêu chảy trên heo của các chủng Bacillus subtilis đƣợc thử nghiệm đƣợc kích thích ở một nồng độ E. coli đủ lớn.
Bảng 4.1: Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis
phân lập đƣợc với E. coli ở nồng độ pha loãng 10-2 trên môi trƣờng TSA.
Chủng Vòng kháng Khuẩn / mm S2 Chủng Vòng kháng khuẩn / mm S2 n = 3 X n = 3 X 1 0 0 14 4,33 0,083 2 0 0 18 5 0 3 0 0 23 2,33 1,083 4 0 0 24 0 0 5 4 0 25 0 0 6 2 0,25 26 1,33 1,33 7 4,33 0,33 27 1,33 1,33 8 0,66 1,33 29 0 0 10 3,83 0,58 33 0 0 11 3,16 0,585 34 0 0 12 0,833 2,08 35 2,5 0,25 13 3,16 0,083
n: Số lần lặp lại X : Giá trị trung bình S2
Theo kết quả đối kháng trên thạch TSA ở nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli
là 10-2 thì chủng số 7, 5, 10, 14, 18 tạo vòng kháng khuẩn lớn nhất nên đƣợc sử dụng để đánh giá sự đối kháng trong môi trƣờng TSB.
Hình 4.2: Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2.
4.1.3 Kết quả đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trong môi trƣờng TSB
Khi cho đối kháng giữa Bacillus subtilis và E. coli trong môi trƣờng TSB sau từng thời điểm đánh giá sự thay đổi của số lƣợng E. coli trong môi trƣờng. Vì Bacillus subtilis phát triển tạo thành màng biofilm trên bề mặt môi trƣờng, trong môi trƣờng lƣợng Bacillus subtilis tự do khoảng 105 vi khuẩn / ml nên giới hạn độ pha loãng để đếm số lƣợng vi khuẩn E. coli ở độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7. Ta có kết quả đƣợc thể hiện ở biểu đồ bên dƣới.
0 5 10 15
log
0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ chủng 5 chủng 7 chủng 10 chủng 14 chủng 18 đối chứng âm
Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi số lƣợng E. coli qua các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ.
Bảng 4.2: Bảng số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ.
Thời gian Chủng
0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ
5 4,45.1010 29,8.108 15,75.107 < 106 7 4,45.1010 19,95. 108 9,55. 107 < 106 10 4,45.1010 17,26. 108 8,3. 107 < 106 14 4,45.1010 19,95. 108 13,67. 107 < 106 18 4,45.1010 23,4. 108 2,6. 107 < 106 Đối chứng âm 4,45.1010 22,15.1011 61,76.1011 23.1012
Biểu đồ trên cho thấy sự giảm số lƣợng E. coli qua từng thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, ở thời điểm 36 giờ kết quả không thấy sự hiện diện của E. coli ở độ pha loãng 10-5
từng thời điểm còn đối chứng âm thì số lƣợng E. coli tăng dần, sự giảm số lƣợng E. coli do Bacillus subtilis sản xuất chất kháng khuẩn tiêu diệt E. coli đồng thời có sự cạnh tranh chất dinh dƣỡng giữa Bacillus subtilis và E. coli cùng với các tƣơng tác khác trong môi trƣờng đã làm giảm số lƣợng vi khuẩn E. coli. Việc số lƣợng vi khuẩn
E. coli giảm ngay từ giai đoạn đầu từ 0 giờ đến 12 giờ, cho thấy Bacillus subtilis tổng hợp kháng sinh ức chế E. coli từ giai đoạn rất sớm, sự giảm E. coli trong giai đoạn này chủ yếu là sự tác động của kháng sinh do Bacillus subtilis tiết ra vì trong giai đoạn này nguồn dinh dƣỡng trong môi trƣờng còn nhiều, đồng thời số lƣợng của 2 loài vi khuẩn chƣa cao nên ít xãy ra các tƣơng tác khác với nhau trong môi trƣờng.
Kết quả trên cho thấy đƣợc cả 5 chủng mặc dù tạo vòng kháng khuẩn không lớn nhƣng cho thấy sự ức chế một cách hiệu quả E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo trong môi trƣờng TSB.
4.1.4 Kết quả thử kháng sinh đồ
Chủng
Kháng sinh 7 5 10 18 14
Gentamicin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy
Ciprofoxacin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy
Amoricillin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy
Colistin Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng
Norfloxacin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy
Kanamicin Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy
Amox/Clav acid Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy Nhạy
Bảng 4.3: Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng
Tất cả 5 chủng đều rất nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc sử dụng trừ colistin, điều này có thể do nguồn gốc phân lập vì các chủng Bacillus subtilis đƣợc phân lập trên những heo khỏe mạnh nuôi trong các hộ gia đình với số lƣợng nhỏ nên ít xuất hiện bệnh, cho nên hầu nhƣ không bị xử lý với kháng sinh nên ít xãy ra hiện tƣợng đề kháng với kháng sinh, đồng thời thức ăn chủ yếu là thức ăn thừa của ngƣời và các loại thức ăn có tính chất tự nhiên khác nên không có kháng sinh đƣợc bổ sung
trong thức ăn. Tất cả các chủng đều kháng với colistin vì colistin là kháng sinh chỉ tác động chuyên biệt đối vi khuẩn gram (-).
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy cả 5 chủng đều an toàn về mặt sinh học vì không chứa plasmid hoặc các gene kháng kháng sinh của các kháng sinh đƣợc sử dụng do đó nó không phải là nguồn truyền những gene kháng kháng sinh cho các vi sinh vật gây bệnh trong đƣờng ruột tuy nhiên cần mở rộng thử nghiệm với các loại kháng sinh khác.
Hình 4.3: Kết quả thử kháng sinh đồ của chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc.
4.1.5 Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% tinh bột 1%
Trong 22 chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trong phân heo có 6 chủng tạo đƣợc vòng phân giải lớn là chủng 8 (9,66 mm), 18 (8,66 mm), 24 (14,66 mm), 25 (9,83 mm), 34 (10,66 mm), 29 (9,83). Các chủng này cho thấy đƣợc khả năng phân giải tinh bột cao đặc biệt là chủng 24 tạo đƣợc vòng phân giải là 14,66 mm. Tuy không cho đối kháng với E. coli nhƣng với khả năng phân giải tinh bột cao chủng 24 là ứng cử viên cho việc sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis có tác động làm tăng hiệu quả chuyển hóa thức ăn của thú, tuy nhiên cần phải đánh giá thêm một vài đặc điểm khác nhƣ khả năng tổng hợp protease, tính an toàn đối với thú và các đặc điểm khác yêu cầu đối với chủng vi sinh vật đƣợc chọn để sản xuất probiotic. Trong 6 chủng tạo vòng
phân giải lớn có chủng 18 (8,66mm), là chủng đối kháng mạnh với E. coli gây bệnh
tiêu chảy trên heo cho nên chủng 18 là ứng cử viên để tạo sản phẩm probiotic 2 chức năng. Một là khống chế E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, hai là giúp tăng hệ số chuyển hóa thức ăn của thú.
Bảng 4.4: Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis
phân lập đƣợc trên môi trƣờng tinh bột 1%
Chủng Đƣờng kính vòng Phân giải / mm S2 Chủng Đƣờng kính vòng phân giải / mm S2 n = 3 X n = 3 X 1 6,66 0,33 14 6 1 2 6,66 8,33 18 8,66 0,33 3 8 1 23 6,33 1,33 4 0 0 24 14,66 2,33 5 7,5 5,25 25 9,83 0,083 6 9,33 0,33 26 7 1 7 6,66 1,33 27 7,5 0,75 8 9,66 7,58 29 9,83 0,58 10 4,33 0,33 33 9,33 0,33 11 8,16 1,58 34 10,66 5,33 12 8,5 0,75 35 9 0,25 13 5,33 0,33
n: Số lần lặp lại S2: Biến lƣợng X: Giá trị trung bình đƣờng kính vòng phân giải
4.2 Thảo luận
Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy rất phổ biến trên ngƣời và trên heo, do tính chất đề kháng rất nhanh với nhiều loại kháng sinh khác nhau, cho nên việc sử dụng kháng sinh để kiểm soát E. coli trở nên kém hiệu quả, bên cạnh đó sử dụng kháng sinh làm xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và xuất hiện ngày càng nhiều các chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho ngƣời tiêu dùng, do đó cần tìm một biện pháp để thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh tiêu chảy nói riêng và các bệnh đƣờng ruột nói chung. Sử dụng probiotic đƣợc là một giải pháp thay thế hiệu quả nhất ở thời điểm hiện nay.
Có nhiều sản phẩm probiotic trên thị trƣờng để phòng các bệnh đƣờng ruột, các sản phẩm này đƣợc dán nhãn là bào tử của Bacillus subtilis tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy, phần lớn các sản phẩm là bào tử của của những loài Bacillus
khác nhƣ Bacillus clausii, Bacillus pumilus và một số chủng Bacillus cereus (Le H. Duc, 2004). Những nghiên cứu gần đây đã làm gia tăng sự lo ngại của ngƣời tiêu dùng về tính an toàn của những sản phẩm này, nhất là những sản phẩm chứa bào tử của các chủng Bacillus cereus, là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh đƣờng ruột. Bên cạnh đó các chủng này đề kháng đƣợc với nhiều loại kháng sinh do đó nó là nguồn phổ biến gene kháng kháng sinh cho vi sinh vật trong đƣờng ruột.
Trong 22 chủng Bacilus subtilis phân lập đƣợc trong phân heo, có 5 chủng đối
kháng mạnh với E. coli trên môi trƣờng TSA và TSB, kết quả kháng sinh đồ cho thấy
các chủng này nhạy cảm với đa số kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin có tác động chuyên biệt với vi khuẩn gram (-). Các chủng này là ứng cử viên để tạo sản phẩm probiotic có tác dụng khống chế E. coli gây bệnh.
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1. Kết luận
Có sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trong phân heo.
Có thể sự tổng hợp kháng sinh ức chế sự phát triển E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo của Bacillus subtilis đƣợc kích thích bởi một nồng độ vi khuẩn E. coli đủ lớn
Kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli đƣợc tổng hợp từ giai đoạn đầu của sự phát triển.
Năm chủng Bacillus subtilis cho thấy khả năng ức chế mạnh sự phát triển của
E. coli và đều nhạy cảm với tất cả kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin.
Chủng 18 là ứng cử viên để tạo ra sản phẩm probiotic có 2 chức năng: Một là khống chế E. coli gây bệnh, hai là tăng hiệu quả chuyển hóa thức ăn của thú.
5.1. Đề nghị
Sự tổng hợp kháng sinh ức chế sự phát triển của Bacillus subtilis có thể đƣợc kích thích bởi sự hiện diện của E. coli trong môi trƣờng đây là điều khác biệt so với quá trình điều hòa tổng hợp của các kháng sinh khác do Bacillus subtilis tiết ra. Chúng tôi có một số đề nghị sau.
Đánh giá hàm lƣợng kháng sinh tiết ra trong môi trƣờng nuôi cấy qua từng
thời điểm.
Đánh giá khả năng đối kháng với nhiều loại vi sinh vật khác.
Kiểm tra sự an toàn của các chủng trên chuột.
Đánh giá khả năng chống chịu của bào tử với pH thấp và enzyme pepsin
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Trần Linh Thƣớc, 2003. Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật trong nƣớc, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo Dục, 232 trang
2. PGS.TS.Trần Thị Dân, 2005.Công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc, NXB