Trong cuộc cạnh tranh giữa sự phát triển kháng sinh mới với sự đề kháng mới của vi sinh vật, thì cho đến nay vi sinh vật vẫn chiếm ưu thế. Quá trình này được thúc đẩy mạnh, nếu thiếu sự hiểu biết và sử dụng thuốc sai trong điều trị.
Có hai dạng đề kháng: đề kháng giả và đề kháng thật.
2.4.2.1. Đề kháng giả
Khi hệ thống miễn dịch của cơ thể suy giảm (do dùng corticoid, tia xạ, …) hoặc chức năng của đại thực bào bị hạn chế (ví dụ ở ổ mủ), thì cơ thể không đủ khả năng loại trừ được những vi khuẩn đã bị kháng sinh ức chế ra khỏi cơ thể.
Khi vi khuẩn tự đề kháng: Ở trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa do thiếu oxy, pH thay đổi …), vi khuẩn không chịu tác dụng của kháng sinh.
Khi có vật cản, tuần hoàn ứ trệ, kháng sinh không thấm tới ổ viêm thì vi khuẩn cũng tỏ ra đề kháng.
2.4.2.2. Đề kháng thật
Đề kháng tự nhiên: Một số loại vi khuẩn luôn luôn không chịu tác dụng của một số kháng sinh. Ví dụ P. aeruginosa kháng với penicillin G, tụ cầu không chịu tác dụng của colistin.
Một số vi sinh vật không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách như penicillin, cephalosporin, vancomycin.
Đề kháng thu được: Do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng.
Đột biến gen: Biến cố này có thể xảy ra trước hoặc sau khi tiếp xúc với kháng sinh.
− Đột biến một bước: Mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng rất cao.
− Đột biến nhiều bước: Mức độ đề kháng có liên quan đến mức độ kháng sinh. Trong trường hợp này, kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sẽ cao hơn lần trước.
Gen đề kháng sau khi xuất hiện sẽ lan truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn.
Nhận gen đề kháng: Gen đề kháng có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức vận chuyển chất liệu di truyền như sau:
− Tiếp hợp: Hai vi khuẩn tiếp xúc nhau và truyền cho nhau gen đề kháng. − Biến nạp: Khi vi khuẩn đề kháng bị ly giải, giải phóng các đoạn DNA tự
do và những đoạn này xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác.
Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2007 đến tháng 07 năm 2007 tại Phòng vi sinh thực phẩm – Khoa LAM – Viện Pasteur Tp. HCM.
3.2. Vật liệu
Nhóm 1: nước uống đóng chai
Nhóm này gồm 2 loại: nước uống tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên. Nhóm 2: nước uống xử lý: nước uống được xử lý không theo quy trình công nghiệp khép kín, nước nguồn có thể là nước giếng hoặc nước máy được lọc bằng các máy lọc nước thông thường hoặc bằng cách đun sôi.
Nhóm này gồm các loại: nước uống trường học, nước uống gia đình, nước uống công ty được khách hàng mang đến viện Pasteur phân tích. Ngoài ra, được xếp vào nhóm này còn có các mẫu nước được chúng tôi lấy từ các bình lọc nước uống trong các bệnh viện trong thành phố.
3.3. Thiết bị, hóa chất và môi trƣờng 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ
Tủ sấy để khử trùng khô và một nồi hấp áp lực.
Tủ ấm hoặc nồi cách thủy kiểm tra được nhiệt độ 350C ± 0,50C hoặc ở 370C ± 0,50C.
Tủ ấm hoặc nồi cách thủy kiểm tra được nhiệt độ 440C ± 0,250C hoặc ở 44,50C ± 0,250 C. Bình ủ kỵ khí. pH mét, nhiệt kế. Dụng cụ lọc màng. Đèn UV.
Màng lọc thông thường có đường kính 47mm hoặc 50mm, có đặc tính lọc tương đương với lỗ có đường kính định danh là 0,45µm, nếu chưa được khử trùng thì phải khử trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phiến kính và lá kính.
Pipette Pasteur, pipette 2ml, 5ml. Đĩa petri.
3.3.2. Hóa chất
Cồn
Nước cất, nước nuối sinh l ý
Thuốc thử oxidase, Kovac’s, Nessler, oxy già (H2O2)
3.3.3. Môi trƣờng
Sử dụng các môi trường, thuốc thử và hóa chất của hãng Biorad, thành phần môi trường xem thêm chi tiết ở phụ lục B.
Thạch lactoza TTC với Tegitol 7 Nước pepton lactoza
Nước trypton
Canh thang manitol lauryl trypto với tryptophan Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Thạch mật asculin-nitrua
Thạch sunphit triptoza
Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường King’s B
Thạch dinh dưỡng Canh thang acetamide Thạch Mueller-Hinton
Hình 3.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng
Hình 3.2: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc và đọc kết quả kháng sinh
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Áp dụng theo TCVN 5992-1995 (ISO 5669-2:1991) [11] Nguồn gốc mẫu thí nghiệm:
Nước uống đóng chai: nước tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên. Nước uống xử lý: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống bệnh viện, nước uống gia đình.
Quá trình lấy mẫu:
Sát trùng bên ngoài vòi nước, mở vòi cho nước chảy một lúc rồi hứng vào các chai đựng. Dụng cụ chứa nước là các chai thủy tinh có thể tích 1,25 ml được vô trùng trước khi lấy mẫu.
Lấy mẫu xong phải đậy kín bình chứa rồi nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm và lọc ngay trong ngày. Nếu để sang ngày hôm sau phải được trữ trong tủ mát ở nhiệt độ 40C.
3.4.2. Xử lý số liệu
Từ các kết quả phân lập vi khuẩn của nước uống đóng chai và nước uống xử lý, chúng tôi xử lý số liệu theo thống kê mô tả. Tiếp theo các kết quả về tỉ lệ phần trăm khác biệt được phân tích về mặt ý nghĩa thống kê với P < 0,05 bằng phép kiểm
2 test.
Tính đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa cũng được phân tích sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê theo nhóm (nước uống đóng chai hoặc nước uống xử lý). Trong trường hợp mẫu nhỏ, phép kiểm sẽ được xử lý hiệu chỉnh Yates.
3.4.3. Đánh giá kết quả
Chỉ tiêu vi sinh vật kiểm tra áp dụng theo TCVN 6096:2004 [1]
+ Đọc kết quả:
Trong một chỉ tiêu, nếu số vi khuẩn hiện diện ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai. Nếu số vi khuẩn ≥ 2 thì coi như chỉ tiêu đó không đạt tiêu chuẩn.
+ Biện giải kết quả:
Nếu một mẫu bị vi phạm bất cứ chỉ tiêu nào trong các chỉ tiêu trên thì đều không đạt tiêu chuẩn vi sinh.
Kiểm tra lần đầu Giới hạn
Coliforms tổng số 1x250 ml Không được phát hiện trong
bất kỳ mẫu nào
Nếu ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai
Nếu ≥ 2 thì loại bỏ
Coliform fecal hoặc E. coli 1x250 ml
Streptococcus fecalis 1x250 ml
Pseudomonas aeruginosa 1x250 ml
3.4.4. Phƣơng pháp thử nghiệm vi sinh vật
3.4.4.1. Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và
Escherichia coli giả định
Áp dụng theo TCVN 6187-1:1996; ISO 7899-2:1990(E) [12]. Nguyên tắc
Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc trên môi trường nuôi cấy thạch lactoza chọn lọc hoặc một miếng đệm hấp thụ bão hòa bằng môi trường lỏng chọn lọc chứa lactoza.
Nuôi cấy màng lọc trong 24 giờ ở nhiệt độ 350C hoặc 370C để phát hiện vi khuẩn Coliform, hoặc ở 440C để phát hiện Coliform fecal.
Đếm trực tiếp các khuẩn lạc đặc trưng được hình thành trên màng; cấy chuyển các khuẩn lạc đặc trưng để thử nghiệm xác định khả năng sinh khí và sinh indol. Tính toán số vi khuẩn Coliform, Coliform fecal và E. coli giả định có trong 250 ml mẫu.
Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập:
Thạch lactoza TTC với Tegitol 7 Môi trường khẳng định:
Môi trường để kiểm tra sự sinh khí: Nước pepton lactoza Môi trường để kiểm tra sự sinh indol: Nước trypton
Môi trường ống đơn để kiểm tra sự sinh khí và indol: Canh thang manitol lauryl trypto với tryptophan
Thuốc thử:
Thuốc thử Kovac’s để thử indol
Thuốc thử oxidase dùng cho phép thử oxidase
Cách tiến hành
Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch.
Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliformfecal và E. coli giả định
Lactose TTC + Tergitol 7
- Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase)
- Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-)
Lactose TTC + Tergitol 7 Ủ (37 ± 0,5)0C/18-24 giờ
- Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Nước trypton (sinh indol)
Ủ 370C/ 48 giờ
Ủ 440C/ 24 giờ - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-)
Coliforms tổng số - Thử indol (+)
E.coli giả định
Đếm các khuẩn lạc đặc trưng
(vàng, da cam hoặc đỏ gạch)
Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang
một môi trường xác định
Coliforms
Đếm các khuẩn lạc đặc trưng
(vàng, da cam hoặc đỏ gạch)
Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang một môi trường xác định
Coliform fecal và E.coli
Ủ(44 ± 0,25)0C/18-24 giờ
3.4.4.2. Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân (Streptococcus fecalis)
Áp dụng theo TCVN 6189-2:1996; ISO 7899-2:1984(E) [13]. Nguyên tắc
Đếm liên cầu phân dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn.
Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri nitrua (để ngăn sự sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm) và 2,3,5- triphenyltetrazoli chlorua liên cầu phân sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành focmazan màu đỏ. Sau khi nuôi cấy, tất cả khuẩn lạc đã mọc sẽ cho màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng toàn bộ khuẩn lạc hoặc từ trung tâm, toàn bộ các khuẩn lạc được đếm là liên cầu phân giả định.
Môi trường khẳng định, thạch mật asculin-nitrua, được nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ 440C. Liên cầu phân phát triển trong môi trường này và thủy phân asculin, sản phẩm cuối cùng, 6,7-dihydroxycourmarin sẽ kết hợp với ion Fe3+
cho hợp chất màu nâu vàng tới đen và khuếch tán vào môi trường.
Ngoài ra, tiến hành một phép thử catalase đối với các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường khẳng định. Những khuẩn lạc cho phản ứng asculin dương tính và catalase âm tính thì có thể xem là liên cầu phân.
Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập:
Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Môi trường khẳng định:
Thạch mật asculin-nitrua Thuốc thử catalase:
Cách tiến hành
Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch.
Sơ đồ 3.2: Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân Streptococcus fecalis
Ủ 370
C/ 24h
SLANTZ & BARTLEY
Ủ (37 ± 1)0C/ (44 ± 4)h
Đếm các khuẩn lạc màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc và cấy chuyển các khuẩn lạc điển
hình sang môi trường
Thạch dinh dưỡng Thạch mật asculin – nitrua (BEA)
Ủ(44 ± 0,5)0
C / 48h Thử catalaza (-)
Xuất hiện khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen và/hoặc môi trường bao quanh có màu nâu
hoặc đen
3.4.4.3. Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clostridium)
Áp dụng theo TCVN 6191-2:1996; ISO 6461-2:1986(E) [14]. Nguyên tắc
Lựa chọn các bào tử
Chọn lọc các bào tử có trong mẫu bằng cách đun nóng trong một khoảng thời gian (800C trong 10 phút) đủ để tiêu diệt các vi khuẩn dinh dưỡng.
Lọc qua màng và nuôi cấy
Lọc mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ sao cho các bào tử vi khuẩn (0,2 m) được giữ lại trên màng lọc.
Đặt màng lọc vào môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định (thạch sắt sunphit), tiếp theo ủ ở 370C ± 10C trong 20 ± 4 giờ và 44 ± 4 giờ và đếm các khuẩn lạc có màu đen.
Môi trường nuôi cấy Thạch sunphit triptoza Cách tiến hành
Lọc thể tích nhất định (50 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,2 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch.
Sơ đồ 3.3: Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clotridium)
Thạch - sunphit - tryptoza
Ủ (37 ± 1)0C/(20 ± 4)h và (44 ± 4)h (Ủ trong điều kiện kỵ khí) Đếm các khuẩn lạc màu đen
Bào tử vi khuẩn kỵ khí sunphit
3.4.4.4. Phát hiện và đếm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Áp dụng theo ISO 16266:2006(E) [15]. Nguyên tắc
Lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt trên môi trường chọn lọc và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp.
Sau khi ủ đếm các khuẩn lạc P. aeruginosa giả định trên màng lọc. Các khuẩn lạc tạo sắc tố pyocyanin có màu xanh da trời hoặc màu xanh lá cây được khẳng định là P. aeruginosa, nhưng các khuẩn lạc khác không tạo màu xanh mà lại phát huỳnh quang dưới đèn UV hoặc có màu nâu đỏ cũng yêu cầu khẳng định.
Cấy chuyển các khuẩn lạc cần khẳng định trên màng lọc sang môi trường thạch dinh dưỡng. Sau khi ủ, các khuẩn lạc ban đầu không phát huỳnh quang được thử phản ứng oxidase và các khuẩn lạc có oxidase dương tính được thử khả năng tạo sắc tố và tạo amoniac từ acetamide, các khuẩn lạc ban đầu phát huỳnh quang được thử khả năng tạo amoniac từ acetamide.
Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập:
Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường khẳng định:
Môi trường King’s B Canh thang acetamide Thạch dinh dưỡng Thuốc thử:
Thuốc thử oxidase Thuốc thử Nessler
Cách tiến hành
Lọc một lượng xác định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch.
Sơ đồ 3.4: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa
Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Nessler (mt chuyển màu vàng đỏ gạch) Khuẩn lạc tạo màu xanh da
trời/ xanh lá cây (pyocyanin) Đếm tất cả
Thạch CN
Khuẩn lạc không tạo màu xanh
Kiểm tra dưới đèn UV
Khuẩn lạc màu nâu đỏ, không phát huỳnh quang
Khuẩn lạc không tạo sắc tố pyocianin, phát huỳnh quang
- Thạch dinh dưỡng - Canh thang acetamide - King’ B
Canh thang acetamide
Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h
Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h
- Oxidase (+) - Sinh amoniac
- Phát huỳnh quang dưới UV Sinh amoniac
3.4.5. Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ
Trong nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng, phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch được sử dụng để kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn. Kết quả kháng sinh đồ giúp cho việc điều trị được chính xác và hạn chế việc sử dụng kháng sinh bừa bãi [17][33] [28].
3.4.5.1. Các kháng sinh thử nghiệm
Chọn lựa các kháng sinh thích hợp nhất để thử nghiệm và phúc trình kết quả là một quyết định hay nhất của phòng thí nghiệm lâm sàng để có thể tham vấn được việc trị liệu kháng sinh. Tuy nhiên phòng thí nghiệm có thể tuỳ điều kiện thực tế có thể thêm hay bớt một hay một số kháng sinh. Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn P. aeruginosa với 16 loại kháng sinh theo tiêu chuẩn NCCLS-2007 (Ủy ban quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng) và CA-SFM-2004 (Hội đồng kháng sinh – Hiệp hội vi sinh của Pháp).
Bảo quản kháng sinh:
Các đĩa kháng sinh được đóng gói đảm bảo điều kiện không hút ẩm và được giữ ở nhiệt độ 80C hoặc thấp hơn.
Nên lấy các lọ chứa đĩa kháng sinh còn đóng kín ra khỏi tủ lạnh 1 đến 2 giờ để nhiệt độ trong lọ bằng với nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi mở nắp.
Chỉ sử dụng các đĩa còn hạn dùng, loại bỏ các đĩa kháng sinh quá hạn.
Bảng 3-1: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ
(*) National Committee for Clinical Laboratory Standards (2007), Performance standards for anmicrobial susceptibility testing, Seventeenth informational supplement.
(**)Société Française de microbiologie, COMITÉ DE L’ANTIBIOGRAMME DE LA SOCIETE FRANCAISE DE MICROBIOLOGIE, Communiqué 2004.
Họ kháng sinh Tên kháng sinh Viết tắt Hàm lƣợng Kháng Trung gian Nhạy
Beta- lactamin
Penicillin Piperacillin PIP** 75µg ≤17 - ≥18
Ticarcillin/a.clavulanic TCC* 75/10µg ≤14 - ≥15 Cephalosporin Cephem Cefoperazone CFP* 75µg ≤15 16-20 ≥21 Cefsulodin CFS** 30 µg ≤14 15-21 ≥22 Ceftazidime CAZ* 30µg ≤14 15-17 ≥18 Cefepime FEP* 30µg ≤14 15-17 ≥18
Carbapenem Imipenem IPM* 10µg ≤13 14-15 ≥16
Mono-lactamin Aztreonam ATM* 30µg ≤15 16-21 ≥22
Aminoglycosid
Gentamicin GM* 10µg ≤12 13-14 ≥15
Tobramycin TM* 10µg ≤12 13-14 ≥15
Amikacin AN* 30µg ≤14 15-16 ≥17