2.5.1. Trên thế giới
Bệnh khảm lá mía
- Năm 1927, bệnh khảm virus ở Australia làm giảm năng suất khoảng 39 - 46%,
thiệt hại trên giống Q28 là năng suất vụ tơ giảm 27% và ở vụ gốc giảm 67% (Koike và Gillaspie,1989).
- Theo Koike và Gillaspie (1989), dịng A của virus gây bệnh khảm lần đầu tiên
đƣợc phát hiện năm 1943 trên giống SP34-120 ngồi sản xuất, và cho đến nay ngƣời ta đã tìm thấy 13 dịng virus gây bệnh khảm này tại Mỹ. Trong lịch sử Hawaii là vùng bị bệnh virus tàn phá nặng nề nhất.
- Theo nghiên cứu của Salomon và ctv (2000), bệnh khảm virus làm giảm năng
suất mía 30 - 40% tại quốc gia này.
- Jang và Zhuo (2002) phát hiện đƣợc SCMV gây bệnh trên bắp ở Trung Quốc bằng phƣơng pháp RT - PCR.
Bệnh cằn mía gốc
- Năm 1945, Steind đã cĩ những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia.
- Năm 1998, Y Pan và các cộng sự đã đƣa ra protocol để chẩn đốn Lxx dựa vào cặp mồi Cxx trong dịch khuẩn lạc nuơi cấy và trong dịch chiết nƣớc mía.
- Năm 2003, Stevens Brumbley đã phát triển cặp mồi để phát hiện Lxx trong dịch
chiết nƣớc mía cĩ tính đặc hiệu hơn và đƣợc chứng minh là cĩ độ nhạy cao.
- Năm 2004, Luis E. A. Camargo và ctv đã giải đƣợc trình từ genome của vi khuẩn Gram dƣơng Lxx tác nhân gây bệnh trên cây mía.
- Viện khoa học nơng nghiệp Tây Nam Trung Quốc năm 2004 cũng đã phát hiện
đƣợc vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR.
2.5.2. Trong nƣớc
Bệnh khảm lá mía
Nƣớc ta do điều kiện lịch sử hình thành nên việc nghiên cứu bệnh hại mía nĩi chung và bệnh khảm lá mía nĩi riêng cịn rất mới mẻ so với các nƣớc trong khu vực, cụ thể là:
- Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987) đã kết luận rằng bệnh khảm
lá mía ở nƣớc ta chỉ xuất hiện rải rác, thiệt hại chƣa ở mức đáng quan tâm. Bệnh sau đĩ đƣợc cơng bố gây hại vào năm 1996 (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)
- Nguyễn Huy Ƣớc (1999) cũng đã đề cập đến 4 bệnh virus phổ biến trên mía,
trong đĩ cĩ bệnh khảm mía và đƣa ra một số phƣơng pháp phịng trừ.
- Gần đây cĩ một nghiên cứu sơ về thành phần bệnh hại trên cây mía ở vùng Đơng Nam Bộ (Hà Đình Tuấn, 2004) cũng cĩ đề cập đến sự xuất hiện khơng nhiều của bệnh khảm lá mía.
- Trƣơng Lê Bạch Liên (2005) cũng đã thực hiện việc điều tra trên quy mơ nhỏ
các giống mía trồng tại TTNCMĐ và một số vùng lân cận. Kết quả chỉ ra rằng tình hình nhiễm bệnh là rất ít.
Bệnh cằn mía gốc
RSD là một loại bệnh đã đƣợc phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã cĩ nhiều vùng bị thiệt hại năng nề do RSD gây ra. Tuy nhiên tình hình nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trên cây mía của nƣớc hiện nay vẫn chƣa đƣợc chú ý đi sâu nghiên cứu nhiều. Cụ thể là:
- Năm 1967 – 1986, đã cĩ cuộc điều tra về bệnh học của cây mía ở miên Bắc và
- Năm 1963 trạm thực nghiệm mía Quảng Ngãi xác đinh đƣợc 11 loại bệnh hại mía, trong đĩ bệnh đốm vàng và cháy lá gây thiệt hại nặng nhất.
- Tổng kết của Hồng Thị Mỹ năm 1966 thì ở khu vực phía Nam cĩ 13 loại bệnh
trên mía (Đỗ Ngọc Diệp và ctv, 1987).
- Theo Phan Gia Tân (1999) thì cĩ 12 loại bệnh xuất hiện phổ biến trên cây mía
do tác nhân virus, vi khuẩn, và nấm và 6 loại bệnh khác do yếu tố dinh dƣỡng.
- Tổng kết của Rott và ctv (2000) qua điều tra sơ bộ năm 1999, ở Việt Nam cĩ 21
bệnh phổ biến gây hại trên cây mía.
- Mới đây, ngƣời ta thống kê lại lần nữa số bệnh trên các giống mía miền Đơng
Nam Bộ là 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chƣa biết tác nhân và một số bệnh khác do yếu tố mơi trƣờng gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004).
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu
Đề tài thực hiện gồm cĩ 2 nội dung chính sau:
- Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng.
- Bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR trên một
số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và nơng trƣờng Thọ Vực.
+ Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp
nhuộm STM.
+ Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuơi cấy vi khuẩn Lxx và
nhận dạng khuẩn lạc của nĩ trên mơi trƣờng nuơi cấy.
+ PCR phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10 tháng 05 đến ngày 10 tháng 08 năm 2006.
Địa điểm thực hiện: Phịng Cơng Nghệ Sinh Học Thực Vật - Trung tâm Phân tích Thí nghiệm (TTPT) Trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng và nơng trƣờng ThọVực tỉnh Đồng Nai.
3.3. Vật liệu nghiên cứu
3.3.1. Các giống mía nghiên cứu
6 giống mía sản xuất đƣợc trồng tại TTNCMĐ gồm: C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427, ROC26.
10 giống mía Thái Lan nhập nội năm 2005 là: KU00-1-58, K95-2-156, KU00-1-92, K95-161, K95-156, KU60-1, U-THONG483, K95-50, KU98-009 , KU60-2.
5 giống mía tại nơng trƣờng Thọ Vực: My55-14, VN84-4137, QĐ368, VĐ85-177, VN85-1427.
3.3.2. Virus gây bệnh
Virus Sugarcane Mosaic (SCMV) gây bệnh khảm lá mía.
3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh
3.3.4. Hĩa chất thí nghiệm
- Các hĩa chất nằm trong kít DAS-ELISA (Biorad) gồm: Dung dịch đệm li trích,
dung dịch đệm cho kháng thể, kháng thể, đối chứng âm, đối chứng dƣơng, kháng thể gắn enzym, P-nitrophenyl phosphate (pNPP).
- Dung dịch đệm rửa PBS- Tween.
- Dầu khống dùng để xem kính ở độ phĩng đại 1000 lần.
- Hĩa chất pha mơi trƣờng nuơi cấy Lxx gồm: Bacto agar, pepton đậu nành,
KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, glucose, bovine serum albumin (BSA),
cysteine, nalidixic acid, methionine.
- Hĩa chất cho phản ứng PCR gồm: Taq DNA polymerase, dung dịch đệm
(buffer), MgCl2, dNTPs, polyvinyl pyrolidone (PVP), primer C2.
- Hĩa chất sử dụng trong điện di: Agarose, TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8), blue/orange loading dye 6X (Promega), ethium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích).
3.3.5. Thiết bị và dụng cụ
- Cối chày, eppendorf, bình cồn, bơng gịn, đĩa petri, ống đong, dao, ống bơm.
- Micropipet 10-100-1000 μl, đầu típ các loại, eppendorf (các loại).
- Đĩa ELISA, máy rửa ELISA, tủ ủ, máy đọc ELISA, máy in.
- Nồi hấp vơ trùng (autoclave), tủ sấy, tủ cấy vơ trùng (microflow).
- Máy cất nƣớc, máy đo pH, máy khấy từ, máy đánh sĩng, máy ly tâm.
- Que trang, que cấy các loại, bercher, màng lọc vơ trùng (0,2 và 0,45 μm)
- Máy PCR, bồn điện di, lị viba, máy chụp gel, kính hiển vi quang học.
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.5. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu
Để đảm bảo tính ngẫu nhiên trong quá trình thí nghiệm thì cơng tác điều tra lấy mẫu trên mỗi giống đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Liên hệ bộ mơn Bảo vệ thực vật và bộ mơn giống ở TTNCMĐ để xác định các
giống mía cần thu thập và lấy mẫu.
- Tại mỗi ruộng điều tra (trung bình là 1 hecta) chọn 5 điểm khảo sát.
- Lấy mẫu ngẫu nhiên 5 mẫu/ruộng. 1 mẫu lá (hay mẫu thân) dùng trong phân tích bệnh khảm lá mía hay cằn mía gốc tại 1 điểm điều tra đƣợc lấy ngẫu nhiên
từ 3 cây của 3 hom mía nằm trên 3 hàng xen kẽ nhau (ví dụ nhƣ hàng 1, 3, 5 hay hàng 2, 4, 6) (xem Sơ đồ 3.1).
5 điểm lấy mẫu theo đƣờng chéo gĩc
H1 x x … o x H3 o x … x x H5 x x … o x
Chọn ngẫu nhiên 3 cây trên 3 hàng để lấy mẫu điều
tra Tại 1 điểm điều tra
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra
Chú thích: H1,3,5: Hàng mía điều tra; O: Bụi được kiểm tra; X: Bụi khơng điều tra.
- Mẫu thân mía sau đĩ đƣợc chiết lấy dịch bằng cách đẩy khí: 1 đoạn thân cây
mía (khoảng 10 – 20 cm) đƣợc chặt ra, dùng một ống bơm đẩy dịch chiết từ đầu này sang đầu kia, thu dịch chiết cho vào eppendorf cĩ ghi nhãn cẩn thận về mẫu nhƣ giống, tuổi cây, triệu chứng.
- Mẫu lá và dịch chiết nƣớc mía đƣợc cho vào thùng xốp giữ lạnh và đem về trữ
ở TTPT Đại học Nơng Lâm.
3.4.6. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA 3.4.3.1.Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị chày cối (hấp nƣớc DEPC) để khơ ở tủ âm trƣớc khi nghiền mẫu, pha dung dịch đệm ly trích mẫu (từ 20X xuống 1X). Khi nghiền mẫu thì cắt nhỏ mẫu ra bằng kéo (cĩ sự vơ trùng bằng cồn sau mỗi lần cắt mẫu) để dễ dàng nghiền mẫu. Cụ thể quy trình làm đƣợc tĩm tắt ở Sơ đồ 3.2.
1
2
5
Mẫu lá mía
Cân 0,5 g Cắt nhỏ
Cho vào cối nghiền + Extractionbuffer (2,5ml)
Nghiền
Cho dịch nghiền vào eppendorf
Li tâm ở 4OC, 3 phút, 7000 vịng/phút
Hút dịch trong chuyển sang eppendorf mới
Trữ ở tủ mát 4OC
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA
Chú thích: Subs: Substrate; PC: Positive control; BF: Buffer extraction; 1, 2, 3,.v.v.: Mẫu chẩn đốn; NC: Negative control
Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa, mỗi đĩa đƣợc bố trí: 2 giếng đối chứng dƣơng, 2 giếng đối chứng âm, 2 giếng dung dịch đệm (buffer), 6 giếng chứa chất nền (substrate), cịn lại là các giếng chứa mẫu cần phân tích. Tuy nhiên để đảm bảo tính chính xác cao trong quá trình thực hiện phản ứng, chúng chúng tơi chỉ tiến hành vơ mẫu lá phân tích trong 54 giếng (từ B3 - G11). Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 2 lần trên 2 giếng kề nhau theo chiều dọc của đĩa ELISA (Sơ đồ 3.3).
3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA
Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Pha lỗng kháng thể đa dịng trong dung dịch đệm đến nồng độ 1/100.
Cho hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Các giếng substrate đƣợc thay bằng nƣớc cất siêu lọc với thể tích
tƣơng đƣơng trong suốt quá trình phân tích. Ủ đĩa ở 37OC trong vịng 2 giờ. Sau
đĩ rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 2: Cho 100 μl dịch đệm ly trích vào mỗi giếng BF, pha đối chứng dƣơng
và đối chứng âm trong 1ml nƣớc cất siêu sạch, cho 100 μl đối chứng âm vào giếng NC và 100 μl đối chứng dƣơng vào giếng PC. Với các giếng mẫu, cho
100 μl dịch trích mẫu ở giai đoạn ly trích vào mỗi giếng. Ủ đĩa ở 4OC qua đêm.
Rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 3: Pha dung dịch kháng thể gắn enzym đến nồng độ 1/100. Cho 100 μl
hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC, và các giếng mẫu. Ủ đĩa ở 37O
C trong vịng 2 giờ. Rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch PBS - tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 4: Hịa tan pNPP dạng viên trong dung dịch đệm, cho vào tất cả các giếng
substrate, BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Ủ đĩa ở 37O
C trong 30 phút, đọc kết quả bằng máy đọc ELISA hoặc quan sát sự đổi màu của giếng bằng mắt thƣờng. Sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ đọc lại kết quả ELISA.
Các mẫu lá mía đƣợc chẩn đốn cĩ nhiễm bệnh hay khơng dựa vào:
- Sự đổi màu trong phản ứng DAS-ELISA: giếng nào nếu màu vàng giống mẫu
đối chứng dƣơng thì mẫu đĩ dƣơng tính (+), bị nhiễm SCMV. Các giếng khơng màu trùng với giếng đối chứng âm là mẫu âm tính (-), sạch bệnh khảm lá mía.
Cách tính kết quả:
- Giá trị OD của mẫu = giá trị OD thơ - giá trị OD trung bình của các giếng Substrate.
- Mẫu dƣơng tính: Nếu giá trị OD của mẫu > giá trị ngƣỡng.
- Mẫu âm tính: Nếu giá trị OD của mẫu < giá trị ngƣỡng.
(Giá trị ngƣỡng = 2 x giá trị OD trung bình của các giếng đối chứng âm).
- Một số mẫu cĩ giá trị OD gần ngƣỡng thì khơng chắc chắn là dƣơng tính vì vậy
cần đọc kết quả sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ để cĩ đƣợc kết quả chính xác.
3.4.7. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng
Quan sát đồng ruộng, trên từng ruộng mía, với thời gian trồng và chặt sau khi thu hoạch xong thì sự sinh trƣởng của các cây khơng đều, cĩ cây cao, cĩ cây thấp. Kiểm tra các cây thấp chậm phát triển này cĩ bị bệnh cằn mía gốc hay khơng bằng cách dùng dao bén chặt dọc thân cây mía và quan sát sự đổi màu của các bĩ mạch.
Chỉ tiêu quan sát
- Cây sinh trƣởng và phát triển chậm hơn bình thƣờng, nếu cây bị bệnh đứng gần
cây khỏe mạnh thì rất dễ dàng nhận diện.
- Cĩ hay khơng sự đổi màu của các bĩ mạch bên trong thân cây mía.
- Đốt thân ngắn, đƣờng kính thân giảm so với bình thƣờng.
3.4.8. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng
phƣơng pháp nhuộm STM
Dịch nƣớc mía sau khi chiết đƣợc đem kiểm tra bằng kính hiển vi. Làm tiêu bản mẫu dịch chiết nƣớc mía trên lam kính. Đậy lamen và quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính
hiển vi ở độ phĩng đại là 1000 lần (xem dƣới giọt dầu). Vi khuẩn Lxx cĩ hình gậy,
chiều rộng từ 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, nổi lên trên nền tối của kính hiển vi.
Cây mía đƣợc 10 tháng tuổi thì mới cĩ thể kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp STM, quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: Nhổ cây mía sau đĩ chặt sát gốc cắm vào dung dịch
thuốc nhuộm safranin (thành phần gồm Safranin 10%, cồn 96O và nƣớc cất). Để khoảng
30 phút lấy ra và gọt lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Gọt mỏng ngang thân mía đem soi trên kính hiển vi ở độ phĩng đại 40 - 100 lần, thu đƣợc kết quả các mạch dẫn cĩ màu đỏ hoặc màu vàng. Chỉ tiêu đánh giá nhƣ sau:
- 70 – 84,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm trung bình.
- 85 – 99,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm nhẹ.
- 100 % mạch đỏ: Giống khỏe mạnh.
(Trích dẫn: Hà Đình Tuấn, 2004).
3.4.5. Phƣơng pháp nuơi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx
Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy vi khuẩn Lxx gồm các thành phần sau:
Thành phần hấp - Nƣớc cất = 1000 ml - Bacto agar = 17 g - Pepton = 8 g - K2HPO4 = 1 g - KH2PO4 = 1 g - MgSO4.7H2O = 0,2 g Thành phần lọc - Glucose = 0,5 g - Methionine = 1 g - Nalidixic acid = 0,01 g - BSA = 2 g - Cysteine = 0.1 g
Albumin huyết thanh bị, cysteine, methionine, nalidixic acid và glucose đƣợc lọc vơ trùng và thêm vào các thành phần mơi trƣờng trên sau khi chúng đã đƣợc hấp vơ trùng (thêm vào khi nhiệt độ < 50OC), pH chỉnh về 6,6 với NaOH hay HCl.
Đổ mơi trƣờng vào đĩa petri (khoảng 15 ml/đĩa). Cấy vi khuẩn bằng cách dùng pipet hút 1ml mẫu dịch chiết nƣớc mía nhiễm bệnh đem cấy lên đĩa mơi trƣờng. Dịch chiết nƣớc mía nuơi cấy đƣợc chiết bằng cách đẩy khí và xác định sự hiện diện của vi khuẩn