2.4.7.1.Phƣơng pháp chẩn đốn trực tiếp bằng kính hiển vi
Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc bằng cách đẩy khí từ đầu này sang đầu kia của một đoạn thân cây mía và xem trực tiếp dƣới kính hiển vi (khơng cần nhuộm). Kết quả dƣơng tính trong chẩn đốn phụ thuộc vào kinh nghiệm của ngƣời quan sát rất nhiều, nguyên nhân ở đây là rất khĩ để nhận ra vi khuẩn trong dịch chiết nƣớc mía, đặc biệt là khi nồng độ của chúng trong dịch chiết thấp.
2.4.7.2.Phƣơng pháp huyết thanh học
Nhuộm kháng thể huỳnh quang (flourescent antibody staining)
Harris và Gillaspie (1978) là những ngƣời đầu tiên đƣa ra phƣơng pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (indirect flourescent antibody technique - FAT) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đốn RSD. Brlansky và ctv (1982) đã phát hiện
Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc hiệu để gắn kết Lxx với
Davis (1985) tăng độ nhạy của FAT lên 100 lần bằng kỹ thuật đếm trực tiếp kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF). Màng lọc đƣợc kiểm tra cĩ vi khuẩn gắn huỳnh quang hay khơng bởi kính hiển vi huỳnh quang ở độ phĩng đại 1200 lần.
Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mơ mẫu (Tissue Blot Enzym Immunoassay)
Kỹ thuật Tissue Blot Enzym Immunoassay (TBIA) là một dạng thay đổi của kỹ thuật dot - blot assay, trong đĩ vi khuẩn đƣợc tách ra khỏi mơ bị bệnh nhờ ly tâm và dính lên màng nitrocellulose (NCM). Sau đĩ vi khuẩn sẽ đƣợc nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dƣơng tính đối với vi khuẩn
Lxx khi đem phân tích miễn dịch học.
Dot Blot Assay
Thu dịch chiết từ đốt mía (50 μl) trộn với 10 mM PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS đƣợc lọc qua màng màng lọc NCM kích thƣớc lỗ 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80OC trong 60 phút trƣớc khi đem nhuộm bằng phƣơng pháp EIA/TBIA. Các phản ứng dƣơng tính đƣợc nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.
Evaporative - binding Enzym Linked immunosorbent assay (EB - ELISA)
Phƣơng pháp EB - ELISA do Croft và ctv đƣa ra năm 1994 để chẩn đốn RSD. Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc ly tâm ở 3000 vịng trong 15 phút hay 13000 vịng trong 5 phút. Dịch nổi đƣợc loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm.
Mẫu phân tích đƣợc cho bay hơi hồn tồn trong buồng ủ thống khí ở 350
C. Sau khi ủ mẫu đƣợc đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa khơng kem và kháng thể.
Phƣơng pháp EB - EIA cĩ thể phát hiện vi khuẩn nuơi cấy trong mơi trƣờng với
mật độ thấp hơn 105
tế bào/ml và 5.105 tế bào/trong dịch nhiễm.
Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT - EIA)
Leaman và ctv (1991) sử dụng phƣơng pháp LT- EIA để chẩn đốn RSD và so sánh phƣơng pháp này với phƣơng pháp FADCF. LT - EIA phát hiện đƣợc Lxx ở mật
độ 5.101 tế bào/ml chiết và cho độ chính xác đến 98%. FADCF cĩ khả năng phát hiện
5.101 tế bào/ml và với độ chính xác đến 100%. Tuy nhiên, FADCF khĩ cĩ khả năng
thực hiện đƣợc trên nhiều mẫu cùng lúc. Phƣơng pháp LT - EIA thích hợp cho việc kiểm tra một số lƣợng mẫu lớn.
2.4.7.3.Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ)
Cắt chéo vào mắt mía của một cây mía trƣởng thành bị nhiễm Lxx để xử lý với dung dịch thuốc nhuộm cĩ chứa Safranin. Quan sát sự chuyển màu bên trong thân mía: vùng chuyển thành màu đỏ là khơng cĩ vi khuẩn Lxx và vùng chuyển màu vàng là cĩ chứa vi khuẩn Lxx.
2.4.7.4.Phƣơng pháp chẩn đốn dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử
Chẩn đốn dựa vào việc sử dụng các đầu dị DNA
Chung và ctv (1994) đã sử dụng kỹ thuật lai tại vết bệnh (dot blot hybridization) với 7 đầu dị DNA đặc hiệu cho Lxx.
Kỹ thuật PCR.
Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển nhằm phát hiện Lxx (Pan và các cộng sự, 1998; Taylor và các cộng sự, 2003). Mồi cho các phản ứng này đƣợc thiết kế từ vùng ITS (intergenic transcribed spacer region) giữa gen rRNA 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx.
2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc 2.5.1. Trên thế giới 2.5.1. Trên thế giới
Bệnh khảm lá mía
- Năm 1927, bệnh khảm virus ở Australia làm giảm năng suất khoảng 39 - 46%,
thiệt hại trên giống Q28 là năng suất vụ tơ giảm 27% và ở vụ gốc giảm 67% (Koike và Gillaspie,1989).
- Theo Koike và Gillaspie (1989), dịng A của virus gây bệnh khảm lần đầu tiên
đƣợc phát hiện năm 1943 trên giống SP34-120 ngồi sản xuất, và cho đến nay ngƣời ta đã tìm thấy 13 dịng virus gây bệnh khảm này tại Mỹ. Trong lịch sử Hawaii là vùng bị bệnh virus tàn phá nặng nề nhất.
- Theo nghiên cứu của Salomon và ctv (2000), bệnh khảm virus làm giảm năng
suất mía 30 - 40% tại quốc gia này.
- Jang và Zhuo (2002) phát hiện đƣợc SCMV gây bệnh trên bắp ở Trung Quốc bằng phƣơng pháp RT - PCR.
Bệnh cằn mía gốc
- Năm 1945, Steind đã cĩ những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia.
- Năm 1998, Y Pan và các cộng sự đã đƣa ra protocol để chẩn đốn Lxx dựa vào cặp mồi Cxx trong dịch khuẩn lạc nuơi cấy và trong dịch chiết nƣớc mía.
- Năm 2003, Stevens Brumbley đã phát triển cặp mồi để phát hiện Lxx trong dịch
chiết nƣớc mía cĩ tính đặc hiệu hơn và đƣợc chứng minh là cĩ độ nhạy cao.
- Năm 2004, Luis E. A. Camargo và ctv đã giải đƣợc trình từ genome của vi khuẩn Gram dƣơng Lxx tác nhân gây bệnh trên cây mía.
- Viện khoa học nơng nghiệp Tây Nam Trung Quốc năm 2004 cũng đã phát hiện
đƣợc vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR.
2.5.2. Trong nƣớc
Bệnh khảm lá mía
Nƣớc ta do điều kiện lịch sử hình thành nên việc nghiên cứu bệnh hại mía nĩi chung và bệnh khảm lá mía nĩi riêng cịn rất mới mẻ so với các nƣớc trong khu vực, cụ thể là:
- Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987) đã kết luận rằng bệnh khảm
lá mía ở nƣớc ta chỉ xuất hiện rải rác, thiệt hại chƣa ở mức đáng quan tâm. Bệnh sau đĩ đƣợc cơng bố gây hại vào năm 1996 (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)
- Nguyễn Huy Ƣớc (1999) cũng đã đề cập đến 4 bệnh virus phổ biến trên mía,
trong đĩ cĩ bệnh khảm mía và đƣa ra một số phƣơng pháp phịng trừ.
- Gần đây cĩ một nghiên cứu sơ về thành phần bệnh hại trên cây mía ở vùng Đơng Nam Bộ (Hà Đình Tuấn, 2004) cũng cĩ đề cập đến sự xuất hiện khơng nhiều của bệnh khảm lá mía.
- Trƣơng Lê Bạch Liên (2005) cũng đã thực hiện việc điều tra trên quy mơ nhỏ
các giống mía trồng tại TTNCMĐ và một số vùng lân cận. Kết quả chỉ ra rằng tình hình nhiễm bệnh là rất ít.
Bệnh cằn mía gốc
RSD là một loại bệnh đã đƣợc phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã cĩ nhiều vùng bị thiệt hại năng nề do RSD gây ra. Tuy nhiên tình hình nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trên cây mía của nƣớc hiện nay vẫn chƣa đƣợc chú ý đi sâu nghiên cứu nhiều. Cụ thể là:
- Năm 1967 – 1986, đã cĩ cuộc điều tra về bệnh học của cây mía ở miên Bắc và
- Năm 1963 trạm thực nghiệm mía Quảng Ngãi xác đinh đƣợc 11 loại bệnh hại mía, trong đĩ bệnh đốm vàng và cháy lá gây thiệt hại nặng nhất.
- Tổng kết của Hồng Thị Mỹ năm 1966 thì ở khu vực phía Nam cĩ 13 loại bệnh
trên mía (Đỗ Ngọc Diệp và ctv, 1987).
- Theo Phan Gia Tân (1999) thì cĩ 12 loại bệnh xuất hiện phổ biến trên cây mía
do tác nhân virus, vi khuẩn, và nấm và 6 loại bệnh khác do yếu tố dinh dƣỡng.
- Tổng kết của Rott và ctv (2000) qua điều tra sơ bộ năm 1999, ở Việt Nam cĩ 21
bệnh phổ biến gây hại trên cây mía.
- Mới đây, ngƣời ta thống kê lại lần nữa số bệnh trên các giống mía miền Đơng
Nam Bộ là 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chƣa biết tác nhân và một số bệnh khác do yếu tố mơi trƣờng gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004).
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu
Đề tài thực hiện gồm cĩ 2 nội dung chính sau:
- Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng.
- Bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR trên một
số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và nơng trƣờng Thọ Vực.
+ Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp
nhuộm STM.
+ Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuơi cấy vi khuẩn Lxx và
nhận dạng khuẩn lạc của nĩ trên mơi trƣờng nuơi cấy.
+ PCR phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10 tháng 05 đến ngày 10 tháng 08 năm 2006.
Địa điểm thực hiện: Phịng Cơng Nghệ Sinh Học Thực Vật - Trung tâm Phân tích Thí nghiệm (TTPT) Trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng và nơng trƣờng ThọVực tỉnh Đồng Nai.
3.3. Vật liệu nghiên cứu
3.3.1. Các giống mía nghiên cứu
6 giống mía sản xuất đƣợc trồng tại TTNCMĐ gồm: C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427, ROC26.
10 giống mía Thái Lan nhập nội năm 2005 là: KU00-1-58, K95-2-156, KU00-1-92, K95-161, K95-156, KU60-1, U-THONG483, K95-50, KU98-009 , KU60-2.
5 giống mía tại nơng trƣờng Thọ Vực: My55-14, VN84-4137, QĐ368, VĐ85-177, VN85-1427.
3.3.2. Virus gây bệnh
Virus Sugarcane Mosaic (SCMV) gây bệnh khảm lá mía.
3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh
3.3.4. Hĩa chất thí nghiệm
- Các hĩa chất nằm trong kít DAS-ELISA (Biorad) gồm: Dung dịch đệm li trích,
dung dịch đệm cho kháng thể, kháng thể, đối chứng âm, đối chứng dƣơng, kháng thể gắn enzym, P-nitrophenyl phosphate (pNPP).
- Dung dịch đệm rửa PBS- Tween.
- Dầu khống dùng để xem kính ở độ phĩng đại 1000 lần.
- Hĩa chất pha mơi trƣờng nuơi cấy Lxx gồm: Bacto agar, pepton đậu nành,
KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, glucose, bovine serum albumin (BSA),
cysteine, nalidixic acid, methionine.
- Hĩa chất cho phản ứng PCR gồm: Taq DNA polymerase, dung dịch đệm
(buffer), MgCl2, dNTPs, polyvinyl pyrolidone (PVP), primer C2.
- Hĩa chất sử dụng trong điện di: Agarose, TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8), blue/orange loading dye 6X (Promega), ethium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích).
3.3.5. Thiết bị và dụng cụ
- Cối chày, eppendorf, bình cồn, bơng gịn, đĩa petri, ống đong, dao, ống bơm.
- Micropipet 10-100-1000 μl, đầu típ các loại, eppendorf (các loại).
- Đĩa ELISA, máy rửa ELISA, tủ ủ, máy đọc ELISA, máy in.
- Nồi hấp vơ trùng (autoclave), tủ sấy, tủ cấy vơ trùng (microflow).
- Máy cất nƣớc, máy đo pH, máy khấy từ, máy đánh sĩng, máy ly tâm.
- Que trang, que cấy các loại, bercher, màng lọc vơ trùng (0,2 và 0,45 μm)
- Máy PCR, bồn điện di, lị viba, máy chụp gel, kính hiển vi quang học.
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.5. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu
Để đảm bảo tính ngẫu nhiên trong quá trình thí nghiệm thì cơng tác điều tra lấy mẫu trên mỗi giống đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Liên hệ bộ mơn Bảo vệ thực vật và bộ mơn giống ở TTNCMĐ để xác định các
giống mía cần thu thập và lấy mẫu.
- Tại mỗi ruộng điều tra (trung bình là 1 hecta) chọn 5 điểm khảo sát.
- Lấy mẫu ngẫu nhiên 5 mẫu/ruộng. 1 mẫu lá (hay mẫu thân) dùng trong phân tích bệnh khảm lá mía hay cằn mía gốc tại 1 điểm điều tra đƣợc lấy ngẫu nhiên
từ 3 cây của 3 hom mía nằm trên 3 hàng xen kẽ nhau (ví dụ nhƣ hàng 1, 3, 5 hay hàng 2, 4, 6) (xem Sơ đồ 3.1).
5 điểm lấy mẫu theo đƣờng chéo gĩc
H1 x x … o x H3 o x … x x H5 x x … o x
Chọn ngẫu nhiên 3 cây trên 3 hàng để lấy mẫu điều
tra Tại 1 điểm điều tra
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra
Chú thích: H1,3,5: Hàng mía điều tra; O: Bụi được kiểm tra; X: Bụi khơng điều tra.
- Mẫu thân mía sau đĩ đƣợc chiết lấy dịch bằng cách đẩy khí: 1 đoạn thân cây
mía (khoảng 10 – 20 cm) đƣợc chặt ra, dùng một ống bơm đẩy dịch chiết từ đầu này sang đầu kia, thu dịch chiết cho vào eppendorf cĩ ghi nhãn cẩn thận về mẫu nhƣ giống, tuổi cây, triệu chứng.
- Mẫu lá và dịch chiết nƣớc mía đƣợc cho vào thùng xốp giữ lạnh và đem về trữ
ở TTPT Đại học Nơng Lâm.
3.4.6. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA 3.4.3.1.Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị chày cối (hấp nƣớc DEPC) để khơ ở tủ âm trƣớc khi nghiền mẫu, pha dung dịch đệm ly trích mẫu (từ 20X xuống 1X). Khi nghiền mẫu thì cắt nhỏ mẫu ra bằng kéo (cĩ sự vơ trùng bằng cồn sau mỗi lần cắt mẫu) để dễ dàng nghiền mẫu. Cụ thể quy trình làm đƣợc tĩm tắt ở Sơ đồ 3.2.
1
2
5
Mẫu lá mía
Cân 0,5 g Cắt nhỏ
Cho vào cối nghiền + Extractionbuffer (2,5ml)
Nghiền
Cho dịch nghiền vào eppendorf
Li tâm ở 4OC, 3 phút, 7000 vịng/phút
Hút dịch trong chuyển sang eppendorf mới
Trữ ở tủ mát 4OC
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA
Chú thích: Subs: Substrate; PC: Positive control; BF: Buffer extraction; 1, 2, 3,.v.v.: Mẫu chẩn đốn; NC: Negative control
Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa, mỗi đĩa đƣợc bố trí: 2 giếng đối chứng dƣơng, 2 giếng đối chứng âm, 2 giếng dung dịch đệm (buffer), 6 giếng chứa chất nền (substrate), cịn lại là các giếng chứa mẫu cần phân tích. Tuy nhiên để đảm bảo tính chính xác cao trong quá trình thực hiện phản ứng, chúng chúng tơi chỉ tiến hành vơ mẫu lá phân tích trong 54 giếng (từ B3 - G11). Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 2 lần trên 2 giếng kề nhau theo chiều dọc của đĩa ELISA (Sơ đồ 3.3).
3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA
Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Pha lỗng kháng thể đa dịng trong dung dịch đệm đến nồng độ 1/100.
Cho hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Các giếng substrate đƣợc thay bằng nƣớc cất siêu lọc với thể tích
tƣơng đƣơng trong suốt quá trình phân tích. Ủ đĩa ở 37OC trong vịng 2 giờ. Sau
đĩ rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 2: Cho 100 μl dịch đệm ly trích vào mỗi giếng BF, pha đối chứng dƣơng
và đối chứng âm trong 1ml nƣớc cất siêu sạch, cho 100 μl đối chứng âm vào giếng NC và 100 μl đối chứng dƣơng vào giếng PC. Với các giếng mẫu, cho
100 μl dịch trích mẫu ở giai đoạn ly trích vào mỗi giếng. Ủ đĩa ở 4OC qua đêm.
Rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 3: Pha dung dịch kháng thể gắn enzym đến nồng độ 1/100. Cho 100 μl
hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC, và các giếng mẫu. Ủ đĩa ở 37O
C trong vịng 2 giờ. Rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch PBS - tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 4: Hịa tan pNPP dạng viên trong dung dịch đệm, cho vào tất cả các giếng