VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.4.Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real time PCR và Non Stop Nested PCR
Non Stop Nested PCR
Mục đích
So sánh độ nhạy giữa hai phương pháp để khẳng định tính vượt trội về độ nhạy của phương pháp Real - time PCR nhằm sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên các mẫu thu từ thực tế.
Tiến hành
Sử dụng mẫu tơm nhiễm WSSV nặng lưu trữ tại cơng ty Nam Khoa và tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được tiến hành pha lỗng theo hệ số pha lỗng bậc 10, được một dãy các nồng độ ADN bản mẫu theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-8. Sau đĩ thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR ở các nồng độ 10-1 đến 10-8. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với cả hai phương pháp trên cùng một mẫu ở tất cả các nồng độ pha lỗng. 2 µl dịch tách chiết ADN WSSV ở từng nồng độ pha lỗng được cho vào đồng thời từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Sản phẩm khuếch đại của hai phương pháp được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1 và trên gel agarose 2%.
Dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ xem khả năng phát hiện WSSV của phương pháp Real - time PCR đến nồng độ pha lỗng nào. Căn cứ vào hình điện di sản phẩm qua Non Stop Nested PCR để xác định khả năng phát hiện WSSV của Non Stop Nested PCR đến nồng độ pha lỗng nào. Qua đĩ so sánh khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ mẫu pha lỗng nào của hai phương pháp để xác định độ nhạy giữa Real - time PCR và Non Stop Nested PCR. Phương pháp nào cĩ độ nhạy cao hơn sẽ cĩ khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ pha lỗng thấp hơn.