VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.4.4.Điện di và phân tích kết quả
Sản phẩm sau khi khuếch đại xong được điện di ngay trên thạch agarose 2% cĩ chứa ethidium bromide.
- Nguyên tắc của điện di: nguyên tắc này dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử này tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Dựa vào kích thước các đoạn khuếch đại, các đoạn ADN khác nhau tách nhau ra sau khi điện di. Đoạn khuếch đại càng dài, băng thể hiện trên bản điện di càng gần vị trí giếng nạp mẫu.
- Chuẩn bị gel agarose 2%: cho 4 gram agarose vào 200 ml dung dịch TBE 0,5X, đun chảy hồn tồn, để nguội khoảng 600C rồi thêm 10 µl ethidium bromide (10 mg/ ml), trộn đều, đổ khuơn, để gel nguội trong khoảng 30 phút. Sau đĩ đưa vào khay điện di cĩ chứa dung dịch TBE 0,5X để tiến hành điện di.
- Nạp (load) mẫu: chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 12 µl dung dịch nạp mẫu (loading buffer) (cĩ glycerol và bromophenol blue) vào trong mỗi mẫu thử. Dùng micropipette cho 15 µl mẫu và 15 µl thang ADN chuẩn vào giếng theo thứ tự.
- Điện di trên gel agarose: điện di trong thời gian 30 phút ở 100 V và 50 mA. Sau khi điện di hồn tất (khi thấy vệt màu xanh cách mép gel agarose khoảng 2 – 2,5 cm) lấy khuơn ra khỏi máng và đẩy nhẹ gel lên bàn đọc UV. Xem các băng ADN dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad. Phân tích kết quả điện di dựa trên kích thước đoạn ADN đặc hiệu được xác định dựa trên thang ADN chuẩn (chi tiết ở mục 3.4.5.2).
Chạy Non Stop Nested PCR
Sơ đồ 3.2 Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR
Chuẩn bị hỗn hợp Non Stop Nested PCR
Chạy điện di Mẫu tơm
Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt
Tinh sạch bằng Instagene Matrix
633bp 221bp