i. Phương pháp trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy Asp. niger
Cân chính xác 1g môi trường nhân giống Asp. niger. Nghiền mẫu cùng bột thủy tinh trong môi trường lạnh 4 oC để tránh mất hoạt tính enzyme. Thêm 100 ml nước muối 0,3 %, khuấy đều rồi đem lọc qua giấy lọc thu dung dịch enzyme 1%. Giữ lạnh dung dịch và sử dụng trong vòng 2 ngày.
ii. Xác định hoạt tính CMCase Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (sodium carboxymetyl-cellulose) bằng enzyme ở pH 5.0 và 40 oC. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid và được xác định bằng máy
đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
Cách thực hiện
Phản ứng enzyme
Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40 oC trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút.
Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều
Để phản ứng xảy ra trong khoảng chính xác 40 oC trong 10 phút
Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều thật kỹ để ngừng phản ứng enzyme.
Để tránh bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút.
Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh
Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (AT) Phản ứng thử không
Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40 oC trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút.
Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều.
Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều
Để tránh sự bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút.
Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh.
Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (AB)
Phản ứng của các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm Hút lần lượt 1 ml các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm Thêm vào 1 ml dung dịch cơ chất và lắc đều
Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS. Lắc đều
Dán nilon hay parafilm lên miệng ố nghiệm, đặt vào nồi nước sôi trong 15 phút.
Đưa về nhiệt độ phòng bằng nồi nước lạnh
Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Sử dụng nước cất làm đối chứng (AG)
Đối với nước cất: làm tương tự như trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng nước cất. Đo OD 540 nm (AW)
Tính toán
Tính hệ số glucose
Hệ số glucose được tính bằng công thức
( / G G W C mg ml F A A = − ) Trong đó F: hệ số glucose
CG: nồng độ của dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) AG: độ hấp thụ OD của dung dịch glucose chuẩn AW: độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất Xác định hoạt tính enzyme Sử dụng công thức sau: 1000 1 1 1 ( / ) ( ). . . . . 180 10 1 T B CMCase u g A A F phut ml C = − (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó
AT: độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme AB: độ hấp thu OD của phản ứng thử không
F: hệ số glucose (mg/ml) 1000: chuyển từ mg sang μg
180: trọng lượng phân tử của glucose, đổi từμg sang μmol 10 phút: thời gian phản ứng
C: nồng độ dung dịch mẫu (g/ml)
iii. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu Nguyên tắc
Xác định lượng galacturonic acid là sản phẩm của quá trình thủy phân pectin dưới tác dụng của pectinase không kết tủa bằng ZnSO4
Cách tiến hành
Cho 20 ml dung dịch pectin 1 % vào ống nghiệm rồi tiếp theo cho 10 ml dung dịch enzyme 1 %, lắc đều và cho vào tủ ấm ở 30 oC (dung dịch pectin có pH = 3,9 – 4,1). Sau 60 phút lấy ra thêm vào 2 ml ZnSO4 15 %, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc được đem pha loãng gấp 5 lần dùng cho phản ứng với Antron
Lấy 5 ml Antron cho vào ống nghiệm, rồi cho 2.5 ml dung dịch lọc đã pha loãng, lắc mạnh trong thời gian 10 phút. Sau đó đặt trong nồi cách thủy ở 70 oC trong thời gian 12 phút.
Sau đó lấy ra làm nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng 584 nm.
Tính kết quả
Hoạt tính pectinase được tính bằng công thức
0,340.OD 0, 0104 DVHT m − = Trong đó
OD: mật độ quang của dung dịch sau khi phản ứng với antron m: lượng enzyme lấy tiến hành phản ứng (g hoặc ml)