Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trƣng riêng. Các biện pháp tối ƣu đó liên quan đến những vấn đề.
Trình tự của primer: Trình tự của primer xác định kích thƣớc, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ƣớc lƣợng đƣợc nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thƣờng chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs).
Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2oC, trong đó:
Tm = 2oC x (A+T) + 4oC x (G+C) (Suggs và ctv, 1981). Với A, T, G, C là số lƣợng các nucleotide tƣơng ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ƣớc lƣợng.
Nồng độ MgCl2: ảnh hƣởng lớn đến kết quả phản ứng, ngƣời ta thƣờng thay đổi nồng độ của MgCl2 trƣớc tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.
Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thƣờng khoảng 200 μM.
Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl).
Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thƣờng là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA.
Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dƣ thừa.
Tỉ lệ primer/DNA khuôn: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng dimer – primer sẽ xuất hiện do lƣợng DNA khuôn thấp và lƣợng primer quá cao. Ngƣợc lại, sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản.