Trong quá trình nuôi cấy, thành phần dinh dƣỡng là yếu tố tối quan trọng cho kết quả nuôi cấy. Vì trong nuôi cấy in vtro, tế bào có thể sinh trƣởng và phát triển hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng. Do đó chúng tôi tiến hành nuôi cấy thử nghiệm lƣợng máu với hai mức độ là 0,4 ml và 1 ml để khảo sát nồng độ dinh dƣỡng cần thiết. Kết quả thu đƣợc trong quá trình nhuộm thể hiện qua bảng 4.2
Bảng 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy Lƣợng máu 0,4 ml 1 ml Số mẫu 15 15 Số mẫu thành công 3 3 Số phiến kính quan sát 90 90 Số phiến kính thành công 3 9 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 3,33 10 Số tế bào thành công 5 18
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy theo hai nồng độ máu khác nhau, kết quả khi nuôi cấy với lƣợng máu 0,4 ml và 1 ml đều có số lƣợng mẫu thành công là ba.
Mỗi mẫu nuôi cấy cũng đƣợc trải đều trên sáu phiến kính, nhuộm màu với giemsa 8 % và xem dƣới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần. Kết quả cho thấy khi nuôi cấy mẫu máu 0,4 ml số phiến kính thành công chỉ có ba, và số tế bào ở trung kỳ cũng rất ít (5 tế bào). Nhƣng tăng lƣợng máu số phiến kính thành công lại tăng lên 9 phiến kính và số lƣợng tế bào thu đƣợc ở trung kỳ là 18.
Trên lý thuyết, khi lƣợng máu ít hơn, các tế bào có thể nhận đƣợc nhiều dinh dƣỡng hơn, giúp cho quá trình phân bào đƣợc tốt hơn. Đặc biệt là mẫu máu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI 1640 là môi trƣờng nuôi cấy tốt nhất cho tế bào máu (Kannan và ctv, 2006). Bên cạnh đó, Parkányi và ctv (2004); Kannan và ctv (2006) đã tiến hành nuôi cấy với lƣợng máu chỉ 0,25 ml và 0,3 ml trong 8 ml RPMI 1640 và thu đƣợc rất nhiều tế bào ở trung kỳ. Kết quả của chúng tôi có khác biệt, mẫu máu 1 ml khi nuôi cấy lại cho kết quả tốt hơn mẫu máu 0,4 ml.
Kết quả trên có thể do trong quá trình lấy máu, chúng tôi sử dụng ống có tráng sẵn heparin. Do đó chúng tôi không xác định đƣợc nồng độ heparin thích hợp, nên trong quá trình nuôi cấy máu rất dễ bị đông trở lại.
Vì vậy số lƣợng bạch cầu thu lại trong quá trình nuôi cấy bị mất đi rất nhiều. dẫn đến tỷ lệ thành công khi nuôi cấy 0,4 ml máu thấp hơn nuôi cấy 1ml máu do số lƣợng bạch cầu ít hơn.
Do đó, chúng tôi đã bổ sung thêm heparin vào các ống kháng đông có tráng sẵn heparin và kết quả nuôi cấy máu không bị đông. Chúng tôi thu rất nhiều tế bào bạch cầu trên phiến kính, nhƣng số lƣợng bạch cầu thu đƣợc ở trung kỳ rất thấp. Điều này do chúng tôi không xác định lƣợng heparin thích hợp khi bổ sung vào ống đã tráng sẵn heparin. Vì vậy heparin có thể ảnh hƣởng không tốt đến kết quả nuôi cấy. Theo Eldridge (1985) thì lƣợng kháng đông heparin thích hợp là 14,3 IU/ml máu, trong khi đó Margre và ctv (1992) cho là 10 – 20 IU/ml máu là thích hợp. Một yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả nuôi cấy là do chúng tôi chỉ bổ sung 10% FBS trong môi trƣờng nuôi cấy. Với hàm lƣợng FBS này có lẽ chƣa đủ thích hợp đối với tế bào máu thỏ, điều này làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của bạch cầu.
Theo George (1994), Parkányi và ctv (2004); Kannan và ctv (2006), đều nuôi tế bào trong môi trƣờng RPMI 1640 và bổ sung FBS 20 %, và kết quả thu nhiều tế bào ở trung kỳ. Mặt khác, các tác giả khác khi nuôi cấy tế bào để nghiên cứu NST đều dùng chất kích thích phân bào là PHA còn chúng tôi sử dụng Pokeweed. Trên thực tế PHA đƣợc sử dụng phổ biến hơn Pokeweed. So PHA thì khả năng làm lắng tụ hồng cầu cũng nhƣ kích thích tế bào bạch cầu phân chia của Pokeweed yếu hơn (Margre và ctv, 1993). Vì vậy có thể ảnh hƣởng không tốt đến kết quả nuôi cấy.