Chúng tôi chƣa thể xác định đƣợc số lƣợng cũng nhƣ xây dựng kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ vì số tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất thấp, và NST chƣa rải đều trên phiến kính. Kết quả nhuộm không tốt có thể do một số yếu tố sau:
a) Thao tác lấy máu
Việc lấy máu ảnh hƣởng khá lớn đến kết quả nuôi cấy. Khi lấy máu ở tim, lƣợng máu lấy đƣợc nhiều và nhanh hơn lấy máu ở động mạch giữa tai. Vì vậy máu nhanh chóng đƣợc hòa tan với chất kháng đông hơn, do đó trong quá trình nuôi cấy mẫu máu ít bị đông hơn so với lấy máu ở động mạch giữa tai. Tuy nhiên việc lấy máu ở tim đòi hỏi ngƣời lấy phải có kinh nghiệm nếu không rất dễ gây chết thỏ.
Ngoài ra vấn đề vô trùng trong lúc lấy máu cũng ảnh hƣởng đến kết quả nuôi cấy. Máu ở môi trƣờng ngoài rất khó bảo đảm điều kiện vô trùng, mặt khác máu sau khi lấy xong không thể xử lý vô trùng nhƣ lọc hay hấp. Vì thế mẫu máu rất dễ bị nhiễm khuẩn trong khi lấy. Khi bị nhiễm các tế bào nuôi cấy bị cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng bởi vi khuẩn. Vì thời gian để tế bào động vật nhân đôi rất chậm (khoảng 20 – 40 giờ), trong khi đó thời gian để vi khuẩn nhân đôi là một giờ. Mặt khác tế bào động vật không thể tồn tại ở dạng cô lập, do đó chúng sẽ không sống đƣợc nếu không đƣợc cung cấp môi trƣờng phức hợp. Nếu bị nhiễm, môi trƣờng sẽ thay đổi, tế bào sẽ chết hoặc bị phá hủy.
b) Chất kháng đông
Hàm lƣợng kháng đông cũng ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình nuôi cấy. Chúng tôi sử dụng ống có tráng lớp kháng đông sẵn, nhƣng sau những lần nuôi chúng tôi nhận thấy máu rất dễ bị đông. Khi hàm lƣợng kháng đông không đủ sẽ máu cấy sẽ bị đông lại và số lƣợng bạch cầu sẽ bị mất rất nhiều và không tìm thấy các tế bào ở giai đoạn metaphase. Ngoài ra khi mẫu nuôi cấy bị đông sẽ ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình đồng nhất mẫu, làm các tế bào kết dính không tách nhau ra, do đó khi đồng nhất mẫu không đủ lực cơ học làm vỡ màng nhân, giải phóng NST.
c) Thao tác nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
Tủ cấy và dụng cụ thao tác phải đƣợc chiếu tia UV trƣớc mỗi lần thực hiện, tất cả dụng cụ phải đƣợc sát trùng cẩn thận trƣớc khi mang vào phòng cấy và tủ cấy vô trùng.Chú ý lắc đều môi trƣờng và mẫu máu khi đƣa vào môi trƣờng.
Giai đoạn đầu chúng tôi nuôi cấy không thành công có thể do thao tác đƣa máu vào môi trƣờng chúng tôi lắc không đƣợc đều, và kết quả các tế bào không tan đều trong môi trƣờng làm chúng đông lại tạo một lớp tế bào máu nổi trên bề mặt môi trƣờng. Do đó chúng tôi bị mất rất nhiều tế bào, nên kết quả không tốt. Khi lắc đều, các tế bào máu sẽ trải đều và nằm dƣới đáy chai Rough.
e) Thời gian ngâm dung dịch nhƣợc trƣơng
Chúng tôi tiến hành ngân dung dịch nhƣợc trƣơng 15 phút trong bồn ủ nhiệt và tiến hành ly tâm 10 phút, tổng thời gian chỉ 25 phút. Với thời gian này, chúng tôi nhận thấy một số tế bào màng nhân vẫn còn, và NST không thể phóng thích và đƣợc trải đều ra. Nhƣ Hayes (2002) và Kannan (2006) và nhiều protocol khác đều có tổng thời gian ngâm với dung dịch nhƣợc trƣơng là 30 phút.
Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chƣa vỡ (X 1000)
f) Thao tác trải đều nhiễm sắc thể
Các nhiễm sắc thể ở trung kỳ khi cố định đều trên phiến kính không trải đều nhƣ mong nuốn. Có thể do mẫu nuôi cấy bị đông, làm các tế bào kết dính lại, khi nhỏ xuống phiến kính rất khó phân tách ra.
Một nguyên nhân nữa là do khi nhỏ giọt dung dịch chƣa nhân tế bào bạch cầu, chúng tôi chỉ tiến hành với độ cao là 40 – 60 cm. Có thể trong môi trƣờng thí nghiệm đối với tế bào máu thỏ thì độ cao này chƣa thích hợp nhất.
Hình 4.5 Nhiễm sắc thể không trải đêu trên phiến kính (X 1000)
d) Thiết bị thí nghiệm
Độ phóng đại của kính hiển vi và độ phân giải của máy ảnh là một yếu tố ảnh hƣởng lớn đến kết quả. Ban đầu chúng tôi chụp hình bằng máy kỹ thuật số, các hình thu đƣợc rất mờ và khó nhận dạng nhiễm sắc thể. Khi chuyển sang chụp trên máy ảnh có gắn trực tiếp lên kính hiển vi thì tấm ảnh đẹp hơn và có thể quan sát nhiễm sắc thể rõ hơn.
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
־ Quy trình nuôi cấy 1ml máu thỏ trong thời gian 72 giờ ở 37 0C để nhuộm nhiễm sắc thể cho kết quả tốt nhất
־ Ủ tế bào sau khi nuôi cấy với colcemid 60 phút trƣớc khi đem nhuộm thu đƣợc nhiều tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhất.
־ Ống nghiệm 15 ml có thể sử dụng nuôi cấy tế bào máu trong nghiên cứu nhiễm sắc thể.
5.2 Đề nghị
־ Thử nghiệm nồng độ kháng đông heparin thích hợp.
־ Khảo sát thêm thời gian ngâm colcemid đối với tới bào thỏ. ־ Khảo sát thêm nồng độ FBS trong môi trƣờng nuôi cấy.
־ Tiếp tục xây dựng kiểu nhân (karyotype) của thỏ và xác định số lƣợng NST thỏ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Dƣơng Nguyên Khang, 2006. Sinh lý thể dịch. Sinh lý vật nuôi (PGS.TS Trần Thị Dân, TS Dƣơng Nguyên Khang). Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 89 - 109.
2. Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005. Sinh học phân tử và tế bào cơ sở khoa học của
công nghệ sinh học. Nhà xuất bản giáo dục, Hà Tây. Trang 133 - 192.
3. Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phƣớc, 2006. Nuôi cấy tế bào động vật.
Công nghệ sinh học người và động vật. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 92 - 149.
4. Trịnh Văn Thịnh, 1978. Cơ thể và sinh lý gia súc. Sổ tay thực hành chăn
nuôi thú y. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 3 - 36.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
5. Eldridge F. E., 1985. Laboratory Procedures for chromosome studies.
Cytogenetic of liverstock. The avi publishing company, United States of America. 93 – 112.
7. Ford C. E., Pollock D.L., and Gustavsson I., 1980. Proceedings of the first international conference for the standardisation of banded karyotypes of domestic animals. Hereditas 92: 158 - 160.
8. Hayes H., Rogel-Gaillard C., Zijlstra C., Haan de A. N., C. U., Bourgeaux N., Bertaud M., and Bosma A. A., 2002. Establishment of R-banded rabbit karyotype nomenclature by FISH lacalization of 23 chromosome-speccific genes on both G-and R-band chromosome. Cytogenet Genome Res 98: 199 - 205.
9. Kannan T. P., Quah B. B., Azlina A., and Samsudin A. R.,2006. Mitotic index and chromosomal analyses for hydroxyapatide. Archives of Orofacial Sciences 1: 15 - 20.
10. Korstanje R., Gillissen G. F., Versteeg S. A., Van OOST B. A., Bosma A. A., Gaillard C. R., Van Zutphen L. F. M., and Van Lith H. A., 2003. Mapping of rabbit microsatellite markers using chromosome specific libraries. Journal of heredity 94: 161 – 169.
11. Nicolai Pand Shaver. E. L, 1977. The Chromosome complement of rabbit blastocysts resulting from spermatozoa stored at 50C. Biology of reproduction
17: 640 -646.
12. Parkányi V., Chrenek P., Rafay J., Suvegová K., Jurcík R., Makarevich A. V., Pivko J., Hetényi L., and Paleyanda R. K., 2004. Aneuploid in the transgenic rabbit. Folia Biologica (Praha) 50: 194 - 199.
13. Robson K. E., and Shaver E. L., 1979. The chromosome complement of rabbit blastocyst resulting from spermatozoa stored in vitro at -196 0C. Biology of reproduction 20: 516 - 522.
14. Sarkar P., Basu P. K., and Miller I., 1962. Karyologic studies on cells from rabbit cornea and other tissues growm in vitro. Investigative Ophthalmology 1: 33 – 40.
15. Seabright M., 1971. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 2: 971 – 972.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN MẠNG
1. George S., 1994. Mitotic metaphase chromosome preparation from peripheral blood for high resolution.
http://biomed.humanapress.com/index.php?option=com_opbookdetails&tas k=chapterdetails&category=biomedprotocols&chapter_code=0-89603-289-2:1
2. Herbert C. M., 1993. Working with animal chromosome.
http://books.google.com.vn/books?id=n97sOVn9iH8C&printsec=toc&dq= working+with+animal+chromosome&psp=1&hl=en#PPP1,M1
4. http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/chromosome.jpg 5. http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/Centromer
6. http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/chromosome.jpg) 7. http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/cycle.jpg)