Có 3 yếu tố quan trọng trong một hệ thống thụ tinh in vitro: dụng cụ thụ tinh, môi trƣờng thụ tinh và các điều kiện khác (khí, nhiệt độ, độ ẩm môi trƣờng…)
Thụ tinh trong ống nghiệm 5 ml:
Thích hợp nhất là ống ly tâm nhựa 5 ml với nắp mở đƣợc vặn lỏng, giúp kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu. Thông thƣờng, tỷ lệ thụ tinh tối ƣu là 1 phức hợp trứng với tế bào cumulus (cumulus oocyte complex-COC)/ ống nghiệm trong 0,5 ml môi trƣờng và 5.104 tinh trùng di động.
Thụ tinh trong đĩa một hay bốn giếng:
Thêm một thể tích huyền phù đã đo trƣớc vào mỗi giếng với nồng độ trung bình là 105 tinh trùng di động/giếng. Sự gắn tinh trùng vào màng trong suốt xảy ra sau 1-3 giờ thụ tinh, do đó sau 3h trứng có thể đƣợc rửa lại để loại bỏ tinh trùng thừa.
Thụ tinh trong ống mao quản và cọng rạ:
Ƣu điểm là tiết kiệm trứng cũng nhƣ tinh trùng. Phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là nuôi cấy trong âm đạo.
Tỷ lệ thụ tinh tốt nhất đạt đƣợc trong các ống mao quản và cọng rạ với thể tích 5-10 µl chứa 2000-4000 tinh trùng di động.
Huyền phù trứng/tinh trùng trong cọng rạ đƣợc bảo vệ bằng các khoảng môi trƣờng, ngăn cách xen kẽ với các bóng không khí, đƣợc đặt nằm ngang trong tủ ấm
37oC và 5% CO2. Sau thụ tinh, dùng pipet đẩy hết dung dịch trong ống vào đĩa để kiểm tra.
Thụ tinh trong vi giọt:
Đây là phƣơng pháp IVF phổ biến nhất. Đƣa các COC vào một vi giọt đã đƣợc chuẩn bị sẵn từ 20-50 µl huyền phù tinh trùng dƣới lớp dầu. Thuận lợi của phƣơng pháp này là kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu bởi thể tích nhỏ và số lƣợng tinh trùng ít, rất phù hợp cho những trƣờng hợp mẫu ít tinh trùng.
Trên chó, thể tích vi giọt dùng cho thụ tinh in vitro tùy thuộc vào loại môi trƣờng, nhƣ thể tích 50 µl/giọt đối với môi trƣờng Fert-TALP (Kim et.al., 2006), thể tích 100 µl/giọt đối với môi trƣờng TYH (Yamada et.al., 1992).