Giảm nhiệt độ bắt cặp từ 600C xuống 560
C, 540C (hình 4.5): 560C 540C 560C 540C 560C 540C ĐC: tăng Mg2+ t.cừu Hình 4.4 Sản phẩm m-PCR sau khi tăng nồng độ Mg2+
Tạp Band bò (274bp) Band cừu (331bp) Band cừu (331 bp) ĐC Hỗn hợp (cừu) Hình 4.5 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh nhiệt độ bắt
Band cừu (331pb)
Band heo (mờ) (398bp)
Tạp
Band bò (mờ) (274bp)
Nhiệt độ bắt cặp có vai trò quan trọng trong phản ứng PCR, nó quyết định khả năng gắn mồi vào khuôn để khởi đầu tổng hợp nên sợi mới, do đó ảnh hƣởng lớn đến khả năng tạo sản phẩm PCR. Nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào Tm của mồi. Nhƣng trong phản ứng m-PCR có nhiều cặp mồi do đó phải lựa chọn nhiệt độ bắt cặp sao sao phù hợp nhất đối với tất cả các mồi, thông thƣờng nhiệt độ này đƣợc lệch so với Tm là 5-100C. Theo Yale (1997), trong phản ứng PCR khi đã sử dụng cặp mồi chuyên biệt mà vẫn không xuất hiện sản phẩm mong muốn thì ta nên tăng khả năng bắt cặp của mồi vào khuôn bằng cách giảm nhiệt độ bắt cặp. Tuy nhiệt độ bắt cặp 600C là phù hợp đối với các đoạn mồi đã đƣợc thiết kế nhƣng trong điều kiện thí nghiệm của chúng tôi ở nhiệt độ bắt cặp này không thu đƣợc sản phẩm PCR của thịt bò. Cho nên chúng tôi đã tiến hành lần lƣợt giảm nhiệt độ bắt cặp xuống còn 560C và 540C. Khi nhiệt độ bắt cặp là 540C, kết quả thu đƣợc cả ba band sản phẩm PCR của ba loài. Tuy nhiên các band này chƣa đƣợc rõ.
Vậy nhiệt độ 540C là nhiêt độ bắt cặp tƣơng đối thích hợp cho việc khuếch đại đồng thời DNA của ba loài thịt heo, bò, cừu.
Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống còn 540C và tăng thời gian biến tính, bắt cặp, kéo dài (lặp lại hai phản ứng). Kết quả thu đƣợc ba band sản phẩm DNA rõ nét hơn nhƣng vẫn chƣa hoàn toàn tối ƣu (band heo, bò còn vẫn mờ) (hình4.6).
Lặp lai lần: 1 2 Lặp lại lần: 1 2 Band bò (274bp) Band cừu (331bp) Hình 4.6 Sản phẩm m-PCR Band heo (mờ)(398bp) Lặp lại lần: Lần 1 lần 2 Tạp
Theo Sambrook và Russell (2001), thời gian của mỗi bƣớc trong giai đoạn lặp lại của các chu kỳ ảnh hƣởng quyết định đến năng suất sản phẩm PCR. Nếu thời gian biến tính không đủ lâu để cắt đứt hoàn toàn các liên kết hidro trong mạch đôi thì giai đoạn bắt cặp sẽ không đạt hiệu quả cao. Thời gian kéo dài chuỗi ngắn quá cũng hình thành sản phẩm không chuyên biệt. Theo lý thuyết, tốc độ kéo dài chuỗi của Taq polymerase là 2000 nucleotide/phút. Tuy nhiên, trong thực tế, ngƣời ta thƣờng thấy loại Taq này kéo dài 1000 nucleotid trong vòng 1 phút. Theo quy trình của Matsugana và ctv (1998), thời gian trong mỗi bƣớc của giai đoạn lặp lại đều là 30 giây. Nhóm tác giả này đã xác định các loại thịt trong hỗn hợp thịt chế biến chính xác đến 100% khi tiến hành với chu trình nhiệt ấy. Nhƣng khi thí nghiệm với cùng chu trình của tác giả, chúng tôi hoàn toàn không thu đƣợc kết quả mong muốn (chỉ đƣợc một band DNA chuyên biệt cho thịt heo). Vì vậy chúng tôi đã tiến hành giảm nhiệt độ bắt cặp đã đƣợc xác định ở phần trên đồng thời tăng thời gian của các bƣớc: biến tính, bắt cặp và kéo dài, kết quả thu đƣợc sản phẩm PCR gồm ba band có thể nhận diện đƣợc ba loài heo, bò, cừu.
Vậy chu trình nhiêt (giai đoạn 2) thích hợp cho phản ứng m-PCR phân biệt ba loài heo, bò, cừu là: biến tính ở 940C/1phút, bắt cặp ở 540C/45 giây, kéo dài ở 720C/1 phút.