A. Kết quả nghiên cứu trên các giống địa lan
3.2. Khảo sát mơi trường nhân giống
Kỹ thuật nuơi cấy mơ tế bào thực vật hiện nay đã xuất hiện và phát triển ở
nhiều phịng thí nghiệm trên khắp thế giới. Nhiều phương pháp nuơi cấy đã được áp dụng nhằm mục đích nhân giống cây trồng, bảo tồn nguồn gen quý, lai tạo, đa dạng hố các kiểu di truyền thực vật. Phương pháp nhân giống vơ tính in vitro được sử
dụng trong đề tài để nghiên cứu ảnh hưởng của khống, vitamin, và chất điều hồ sinh trưởng thực vật trên sự tăng trưởng của ba giống địa lan: Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh.
Nhu cầu dinh dưỡng, điều kiện lý hố với mỗi đối tượng thực vật khác nhau là khơng giống nhau. Do đĩ khơng thể áp dụng quy trình nhân giống của đối tượng này lên đối tượng khác. Khi nghiên cứu trên ba giống địa lan nĩi trên, việc tìm ra phương pháp vơ trùng mẫu cấy, mơi trường nuơi cấy thuận lợi cho sự tái sinh chồi, sự tăng trưởng về kích thước, trọng lượng, chiều cao cũng như sự phân hố của các cơ quan gĩp phần xây dựng quy trính nhân ba giống địa lan nĩi trên.
40
Thơng qua việc bố trí 4 thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của mơi trường nhân giống in vitro lên sự phát triển của địa lan, chúng tơi thu được kết quả sau.
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của mơi trường lên quá trình phát sinh chồi
Để khảo sát các protocorme được nuơi cấy trong các mơi trường cĩ hàm lượng khống khác nhau, mơi trường MS, 1/2MS và mơi trường Knudson C, kết quả sau 2 tháng nuơi cấy chúng tơi ghi nhận kết quả trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của mơi trường lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh
Đối tượng Mơi trường Tỉ lệ chồi hình thành (%) Trắng bệt MS 20 1/2MS 12 Knudson C 16 Tím hột MS 19 1/2MS 12 Knudson C 16 Miretta xanh MS 20 1/2MS 10 Knudson C 11
Trong thí nghiệm này chúng tơi khảo sát từng loại mơi trường cĩ ảnh hưởng như thế nào để số lượng chồi trên từng loại giống. Theo kết quảở bảng 1, biểu đồ 1 và biểu đồ 2 chúng tơi thấy rằng: Với loại mơi trường ½ MS thì cả ba giống đều cho số lượng chồi khơng cao, chúng rất hạn chế trong sự phát sinh protocorme nhưng cịn
đối với loại mơi trường Knudson C thì số lượng chồi cĩ phát triển nhiều hơn so với mơi trường ½ MS số lượng protocom phát sinh đáng kể nhưng protocom cĩ nhiều lơng hút.
Cịn loại mơi trường MS thì lại là khả thi nhất loại mơi trường này cho số
lượng protocom nhiều nhất, ít lơng hút và protocom phát triển đều hơn, sinh trưởng mạnh hơn. Do vậy, chúng tơi sử dụng mơi trường MS làm mơi trường cơ bản trong
quá trình nhân nhanh Cymbidium.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình phát sinh chồi của
Lan Cymbidium
Than hoạt tính khơng phải là chất kích thích sinh trưởng nhưng khi bổ sung vào mơi trường nuơi cấy sẽ cĩ lợi ích và tác dụng khửđộc trong mơi trường, đặc biệt là với các cây họ lan đặc biệt là nĩ cĩ vai trị quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Việc hấp thu các chất ức chế trong mơi trường nuơi cấy hoặc từ mơ cấy tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của Cymbidium sp.. Ngồi ra những nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng quá trình thúc đNy cơ quan biệt hĩa tạo rễ cũng chịu ảnh hưởng của than hoạt tính. Kết quả nghiên cứu trên ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh sau 60 ngày cấy được thể hiện ở bảng 3.3.
41
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh. Đối tượng Hàm lượng than (g/l) Tỉ lệ chồi hình thành (%) Trắng bệt 0 11 0.5 13 1 21 1.5 22 2 19 Tím hột 0 11 0.5 12 1 18 1.5 15 2 2 Miretta xanh 0 8 0.5 8 1 18 1.5 10 2 11
Ở thí nghiệm này chúng tơi quan sát sựảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình phát sinh chồi cho thấy: Với mơi trường MS khơng bổ sung than hoạt tính thì số
lượng chồi khơng nhiều, hình thái cây sinh trưởng rất kém: cây, rễ cĩ phát triển nhưng lại cịn rất nhỏ nên chúng sẽ bị ảnh hưởng trong quá trình sinh trưởng và phát triển ở giai đoạn ex-vitro.
Mơi truờng MS cĩ bổ sung 0.5 g/l than hoạt tính thì cũng như mơi trường MS khơng bổ sung than hoạt tính số lượng protocorme cịn rất thấp, nhưng hình thái cĩ thay đổi hơn là cây cĩ phát triển, rễ cũng phát triển rất mạnh. Như vậy thì với nghiệm thức này thì chủ yếu là rễ phát triển chứ chưa cĩ sự phân chia mạnh để tạo lượng protocorme thích hợp.
Cịn mơi trường MS cĩ bổ sung 1.5 g/l than hoạt tính và 2g/l than hoạt tính thì lượng protocorme tạo ra nhiều hơn 2 nghiệm thức vừa nĩi trên nhưng cây tạo ra cũng chưa nhiều lắm và protocorme cũng khơng đơng đều.
Với mơi trường MS cĩ bổ sung 1 g/l than hoạt tính thì lượng protocorme tạo ra nhiều và vượt trội hẳn các nghiệm thức trên, cây, rễ phát triển mạnh và rất đều.
Qua thí nghiệm này chúng tơi thấy than hoạt tính cũng gĩp phần vào sự phân chia tế bào để tạo ra số lượng protocorme thích hợp, để gĩp phần nhân nhanh
42
Thí nghiệm 3: Sựảnh hưởng của các nồng độ BA đến quá trình phát sinh chồi
BA là một chất điều tiết sinh trưởng nhân tạo thuộc nhĩm Cytokinin, là nhĩm
được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật nuơi cấy mơ hiện nay. Tác dụng chủ yếu của nĩ là kích thích sự phân chia tế bào, thúc đNy sự hoạt động của chồi bên. Nồng độ
sử dụng khác nhau tuỳđối tượng thực vật nuơi cấy, chẳng hạn ở nồng độ 22µM thích hợp với sự phát triển chồi ở Cymbidium aloifolium, nhưng đối với Dendrobium
aphyllum và Dendrobium moschatum nồng độ thích hợp nhất cho sự phát triến của chồi là 44µM (N.R.Nayak và cộng sự, 1997). Để tìm nồng độ phù hợp của BA lên sự
tạo protocorm của các giống Cymbidium sp. trong thí nghiệm này chúng tơi bố trí 5 nồng độ khác nhau: 0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2 mg/l. Sau 12 tuần nuơi cấy, chúng tơi quan sát và ghi nhận được kết quảở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh Đối tượng Hàm lượng than (g/l) Nồng độ BA (ml/l) Tỉ lệ chồi hình thành (%) Trắng bệt 1 0 8 1 0.5 10 1 1 20 1 1.5 14 1 2 12 Tím hột 1 0 10 1 0.5 13 1 1 28 1 1.5 16 1 2 16 Miretta xanh 1 0 6 1 0.5 7 1 1 20 1 1.5 14 1 2 9
Với thí nghiệm này thì giống Tím hột là lồi thích hợp nhất cho sự tạo chồi,
đạt tới 41,5% nhưng số cây hồn chỉnh thì lại rất ít, cịn Trắng bệt và Miretta xanh thì cả 2 lồi này chiếm tỉ lệ ít hơn nhưng lại vừa tạo protocorm vừa tạo cây, Trắng bệt chiếm 31,7% cịn Miretta xanh chiếm khoảng 26,8%.
Với MS + 1g/l than hoạt tính và khơng bổ sung BA và mơi trường MS + 1 g/l tan hoạt tính + 0,5ml/l, với 2 nghiệm thức này thì sự thích nghi của các protocorme cịn rất kém, chứng tỏ đây khơng phải là nồng thích hợp chĩ các protocorme của Địa Lan phát triển.
Tại mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 2ml/l BA thí các protocorm phát triển cũng khơng nhiều, tạo cây và rễ lại cịn phát triển rất mạnh. Ở mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 1,5ml/l BA thì số lượng protocorm cĩ phát triển hơn nhưng cũng
43
chủ yếu là tạo cây và rễ. Nen đây cũng chưa là mơi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh ở cây Địa Lan.
Mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 1ml/l BA lại cho số lượng protocorm là nhiều nhất, một số tạo cây, rễ và một số khác tạo protocorme cũng mạnh , đều. Do đĩ mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 1ml/l BA là mơi trường thích hợp để tiếp tục phục vụ cho quá trình nhân nhanh ở cây Địa Lan.
Thí nghiệm 4: Sựảnh hưởng BA + NAA đến quá trình hình thành chồi
Thí nghiệm này được thực hiện bởi các protocorme nuơi cấy trong mơi trường MS, cĩ than hoạt tính là 1g/l, nồng độ BA là 1ml/l và cĩ bổ sung thêm các nồng độ
NAA khác nhau. Sau 2 tháng nuơi cấy, quan sát, ghi nhận được kết quả như ở bảng 3.5 sau:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA + NAA lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh
Ngược lại với thí nghiệm 3: Miretta xanh nhường như khơng thích hợp với các nồng độ của BA nhưng khi phối hợp với NAA thí các protocorme của Miretta xanh lại phát triển rất tốt, tốt hơn cả Trắng bệt và Tím hột, chiếm tới 41,5% so với tỉ lệ chồi.
Với sự nghiên cứu của các chất điều hịa sinh trưởng thì Trắng bệt là lồi ổn
định nhất , với thí nghiệm ảnh hưởng của BA thì Trắng bệt chiếm 31,7% cịn ở thí nghiệm ản hưởng của sự phối hợp của BA + NAA cũng chiếm với tỉ lệ tương đương là 32,7%. Điều này cho ta thấy được đối với chất điều hịa sinh trưởng như BA hay NAA thì các protocorme của Trắng bệt đều phát triển. Tím hột với thí nghiệm này chỉ
chiếm 26,8%. Qua thí nghiệm này ta thấy được sự thích hợp của các lồi khác nhau
ứng với từng chất điều hịa sinh trưởng là khác nhau.
Đối tượng BA (mg/l) NAA (mg/l) Tỉ lệ chồi hình thành (%) Trắng bệt 1 0 11 1 0.5 15 1 1 22 1 1.5 16 1 2 17 Tím hột 1 0 9 1 0.5 11 1 1 17 1 1.5 12 1 2 12 Miretta xanh 1 0 12 1 0.5 21 1 1 27 1 1.5 23 1 2 24
44
Nồng độ BA + NAA 1: 0ml/l ở mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính thì lượng protocorm tạo ra là kém, ở nồng độ BA + NAA 1: 0,5ml/l protocorme cĩ phát triển hơn BA + NAA 1: 0ml/l nhưng cũng khơng đáng kể, cũng cĩn hạn chế về lượng protocorme.
Ở nồng độ BA + NAA 1:1,5ml/l và nồng độ BA + NAA 1: 2ml/l thì vừa tạo protocorm lại vừa tạo cây. Ở 2 nồng độ này lượng protocorm tạo ra khơng hơn kém nhau bao nhiêu. Cịn ở nồng độ BA + NAA 1:1ml/l hầu hết các lồi là thích hợp, số
lượng protocorme là cao nhất, một số tạo cây, rễ.
3.3. Khảo sát tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của protocorm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm mới của ba giống địa lan tím hột, Trắng bệt và Miretta xanh của
Đà Lạt
Ribazole là hợp chất thuộc nhĩm kháng chuyển hố nucleotide của virus. Ribazole cĩ cấu tạo và tính chất hố học tương tự cả adenosin lẫn guanosin. Bên cạnh
đĩ Ribazole cĩ thể hoạt động độc lập và tuần hồn và đĩ là nguyên nhân mà ribazole tham gia đồng hố vào ARN và AND của virus và ức chế sự nhân bản của virus thực vật trong tế bào. Bên cạnh tác dụng ức chế sự nhân bản của virus thì bản thân ribazole cũng gây ức chế lên sự sinh trưởng và phát triển của tế bào thực vật.
Trong thí nghiệm đã thực hiện với ba giống địa lan Trắng bệt, và Tím hột cho thấy, ở nghiệm thức đối chứng cĩ tí lệ mẫu sống đạt 100 %, trong khi đĩ khi nồng độ
ribazole tăng dần từ 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l, 150 mg/l cĩ tỉ lệ sống giảm dần so với đối chứng khơng sử dụng ribazole (Bảng 3.9 và 3.10). Đặc biệt ở nồng độ 100 mg/l và 150 mg/l thì tỉ lệ sống sĩt giảm rõ rệt.
Ở các nghiệm thức đối chứng số protocorm mới được tạo thành cao hơn hẳn các nghiệm thức cĩ sử dụng ribazole, nồng độ ribazole càng cao thì số protocorm mới phát sinh trên những mẫu cịn sống cũng thấp dần.
Nếu ta so sánh hệ số nhân tính theo những mẫu cịn sống thì ở nồng độ 50 mg/l; 75 mg/l và 100 mg/l là khá cao. Tuy nhiên khi ta so sánh hệ số nhân này tính theo tổng số mẫu ban đầu đưa vào ở nồng độ 100 mg/l của hai giống Trắng bệt và Tím hột thì số protocorm mới thu được thấp hơn số tổng mẫu ban đầu.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm của Trắng bệt Nồng độ (mg/l) 0 (1) 50 (2) 75 (3) 100 (4) 150 (5) Tỉ lệ sống sĩt 100 94,4 83,3 61,1 44,4 Hệ nhân (trên tổng mẫu) 2,9 1, 6 0,9 0,6 0.5
Trong quá trình theo dõi chúng tơi nhận thấy, thời gian bắt đầu phát sinh protocorm mới trong nghiệm thức đối chứng ở cả ba giống là sớm hơn so với các nghiệm thức cịn lại. Ở nghiệm thức đối chứng, giống Trắng bệt bắt đầu phát sinh
45
protocorm mới sau 28 ngày; giống Miretta xanh - 22 ngày; giống tím hột thì sau 21 ngày.
Ở các nghiệm thức sử dụng nồng độ ribazole càng cao thì thời gian bắt đầu phát sinh protocorm càng dài. Ở nghiệm thức (4) và (5) sự phát sinh protocorm mới thể
hiện khơng rõ ràng như nghiệm thức đối chứng, đặc biệt là ở nghiệm thức (5). Ở
giống Miretta xanh, các mẫu ở nghiệm thức đối chứng bắt đầu phát sinh protocorm sau 22 ngày, ở nghiệm thức (2) (3) thì sau 31 ngày, ở nghiệm thức (4) thì sau 37 ngày.
Các mẫu protocorm ở nghiệm thức đối chứng cĩ màu xanh đậm nhất cịn các mẫu cịn sống ở nghiệm thức (5) chuyển sang màu vàng nâu và hầu như khơng cịn màu xanh.
Như vậy, ribazole khơng chỉ ức chế sự tái bản của virus, mà qua các thí nghiệm
đã thực hiện chúng tơi nhận thấy:
Ribazole ức chế sự sinh trưởng và phát triển của protocorm, ở những nghiệm thức cĩ nồng độ càng cao thì sựức chế này càng thể hiện rõ ràng.
Khơng chỉ ức chế sự sinh trưởng và phát triển của các protocorm mà ribazole cịn cĩ thể gây chết mẫu, nồng độ ribazole càng cao thì tỉ lệ mẫu chết càng cao.
Ribazole cĩ mức độ tác động lên ba giống địa lan là khơng giống nhau. Giống Tím hột cĩ hệ số nhân trong các nghiệm thức cĩ ribazole giảm rõ rệt so với đối chứng hơn hai giống cịn lại. Ribazole gây tác động ức chế với mức độ khác nhau cho những cây trồng khác nhau.
Điều này cũng đúng với một số kết quả của một số tác giả khác như: Đối với cây khoai tây, nồng độ ribazole được sử dụng trong khoảng 20- 30 mg/l. Khi sử dụng ribazole trên cây chuối thì nồng độ ribazole là 50 mg/ l nhưng khi sử dụng cho
Nicotiniana Rustica thì nồng độ ribazole lại cao hơn là 100 mg/ l mơi trường nuơi cấy. Trong khi đĩ đối với cây Oxalic Tuberosa Molina thì nồng độ ribazole tối ưu là 50 mg/l mơi trường nuơi cấy (Zapta và cs 1995).
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm của Tím hột Nồng độ (mg/l) 0 (1) 50 (2) 75 (3) 100 (4) 150 (5) Tỉ lệ sống sĩt 100 91,6 77,8 55,5 50.0 Hệ nhân (trên tổng mẫu) 3,4 0,9 0,6 0,4 0,2
Qua thí nghiệm đã tiến hành với ba giống địa lan chúng tơi thấy trong khi nồng
độ ribazole tăng dần thì hệ số nhân của từng giống cĩ sự giảm với mức độ khác nhau so với đối chứng.
Ở giống Tím hột ở nghiệm thức (2) đã cho thấy sự giảm hệ số nhân so với nghiệm thức đối chứng là cao hơn hẳn so với hai giống Miretta xanh và Trắng bệt.
Ở thí nghiêm với giống Trắng bệt và Tím hột, nghiệm thức (4) và (5) cho hệ số
46
sau 80 ngày nuơi cấy trong mơi trường chứa 100 mg/l; 150 mg/ l thì số protocorm thu
được thấp hơn tổng số mẫu ban đầu đưa vào.
Như vậy trong cả 3 giống thì ở hai nghiệm thức (2) và (3) cĩ bổ sung ribazole mà vẫn thu được số protocorm sau thí nghiệm nhiều hơn số protorme mẫu ban đầu.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm của giống Miretta xanh. Nồng độ (mg/l) 0 (1) 50 (2) 75 (3) 100 (4) 150 (5) Tỉ lệ sống sĩt 100 97,2 94,4 77,7 33,3 Hệ nhân (trên tổng mẫu) 3,3 2,6 1,9 0,2 0,1
47
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của ribazole tích luỹ lên sự sinh trưởng và