Kết quả nghiên cứu của Zhou và c.s (1983) đã cho thấy rằng: Xử lý đòng ở nhiệt độ thấp rất có hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn. Điều kiện lạnh làm tăng khả năng tạo cây xanh.
Hiệu quả của xử lý trƣớc nhiệt độ thấp đến việc hình thành callus và cây con đã đƣợc nghiên cứu bởi một số tác giả về một số phƣơng pháp xử lý nhƣ: Xử lý bông đã tách bẹ, xử lý bông chƣa tách bẹ hoặc xử lý bao phấn đã đƣợc nuôi cấy. Tất cả các phƣơng pháp đó đều cho kết quả tốt, Tuy nhiên tốt hơn cả là theo phƣơng pháp của Genovest và Magill (1979), xử lý bông còn nằm trong bẹ lá đòng ở nhiệt độ 10- 130
C trong 10-14 ngày [11]
Tsay và Chen (1984), Lin và Tsay (1984) phát hiện ra rằng những hạt phấn đƣợc xử lý lạnh đột ngột ở 8-100C trong 7 ngày tạo ra nhiều callus hơn gấp 2 lần so với không xử lý. Tuy nhiên kết quả không khác biệt khi xử lý lạnh bao phấn đã cấy trên môi trƣờng.
Theo Chen và Cs (1982), thời gian xử lý lạnh dài 8-10 ngày tốt hơn 2-4 ngày. Tuy nhiên nếu kéo dài thời gian này quá 15 ngày lại ức chế quá trình hình thành callus.
Lin và Tsay (1984), Tsay và c.s (1988) cho biết callus hình thành từ bao phấn đƣợc xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn bội và ít cây lƣỡng bội hơn là từ bao phấn không xử lý, điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng tái sinh thành cây cao.
Các giống khác nhau đòi hỏi điều kiện xử lý khác nhau, trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả của xử lý. Tsay và c.s (1988) thấy rằng khả năng hình thành callus tăng gấp 2 lần khi xử lý bao phấn chứa bào tử ở giai đoạn giữa và cuối một nhân trong 7-14 ngày, quá 14 ngày thì tỷ lệ cây xanh giảm.
Nói chung đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đòng đến kết quả nuôi cấy bao phấn. Kết quả của các tác giả cho thấy rằng xử lý đòng ở nhiệt độ khác nhau sẽ cho kết quả nuôi cấy khác nhau.
1.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.4.1. Khái niệm nuôi cấy bao phấn