3/ Giới hạn nội dung nghiên cứu
2.2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
1/ Quy trình kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa:
Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đƣợc thực hiện theo Quy trình kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa của Viện nghiên cứu cây lƣơng thực và thực phẩm (Hải Dƣơng).
2/ Các thí nghiệm nghiên cứu
Các thí nghiệm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn
* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến khả năng tạo mô sẹo (callus) của mẫu cấy.
Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ 50 mẫu. Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm.
Môi trƣờng nuôi cấy:
N6 + (1,5 mg 2,4D + 60g đƣờng + 100mg inostol/lit môi trƣờng).
Tiến hành vệ sinh đòng sạch sẽ bằng nƣớc sạch rồi khử trùng bằng cồn 750 sau đó gói lại bằng giấy thấm và giấy bạc và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 8 – 100C trong những khoảng thời gian khác nhau.
- CT1: không xử lý lạnh - CT2: xử lý lạnh 1 ngày - CT3: xử lý lạnh 3 ngày - CT4: xử lý lạnh 5 ngày - CT5: xử lý lạnh 7 ngày - CT6: xử lý lạnh 10 ngày
Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng, bắt đầu theo dõi mẫu cấy
Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo callus (mô sẹo) và tỷ lệ mẫu chết.
* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng hypocloratnatri đến tỷ lệ sống của mẫu cấy.
Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ cấy 50 mẫu (bao phấn).
Tiến hành bóc bao lá đòng, ngâm hoa lúa trong chất khử trùng hypocloratnatri ở nồng độ khác nhau với thời gian 20 phút. Sau đó tráng lại bằng nƣớc cất vô trùng 5 lần.
- CT1 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 0,5 % nguyên chất - CT 2: Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 1,0 % nguyên chất - CT 3 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 1,5 % nguyên chất - CT 4 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 2,0 % nguyên chất
Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng bắt đầu theo dõi mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống.
* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS và môi trường N6 đến khả năng tạo mô sẹo (callus)
Thí nghiệm gồm 2 công thức, mỗi công thức làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 20 lọ, mỗi lọ cấy 100 mẫu. Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm.
- CT1: MS + (1,5 mg 2,4D + 30 g đƣờng + 100mg inostol/lit môi trƣờng) - CT2: N6 + (1,5 mg 2,4D + 30 g đƣờng + 100mg inostol/lit môi trƣờng) Sau 30 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng, tiến hành theo dõi mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo và tỷ lệ mẫu chết.
* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo (callus) của mẫu cấy.
Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ cấy 50 mẫu. Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm.
- CT1: Nền + 0 mg 2,4D/lit môi trƣờng - CT2: Nền + 0,5 mg 2,4D/lit môi trƣờng - CT3: Nền + 1,0 mg 2,4D/lit môi trƣờng - CT4: Nền + 1,5 mg 2,4D/lit môi trƣờng - CT5: Nền + 2,0 mg 2,4D/lit môi trƣờng - CT6: Nền + 2,5 mg 2,4D/lit môi trƣờng
Môi trƣờng nền: N6 + (60g đƣờng + 100g inostol + 6,5 g agar/lit môi trƣờng)
Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng bắt đầu theo dõi mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (callus), tỷ lệ mẫu chết.
* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo mô sẹo (callus)của mẫu cấy
Thí nghiệm gồm 6 công thức, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ 50 mẫu . Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm.
- CT1: Nền + 0 mg NAA /lít môi trƣờng - CT2: Nền + 0,5 mg NAA /lít môi trƣờng - CT3: Nền + 1,0 mg NAA/lít môi trƣờng - CT4: Nền + 1,5 mg NAA/lít môi trƣờng - CT5: Nền + 2,0 mg NAA/lít môi trƣờng - CT6: Nền + 2,5 mg NAA /lít môi trƣờng
(Môi trƣờng nền: N6 + 60g Đƣờng + 100g Inostol + 6,5 gam Agar/lit môi trƣờng)
Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng, bắt đầu theo dõi mẫu Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu ra mô sẹo, tỷ lệ mẫu chết.
* Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất Kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo (callus).
Thí nghiệm gồm 8 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 5 lọ, mỗi lọ 10 mẫu cấy. Mẫu cấy là những callus đạt tiêu chuẩn.
- CT1: Nền + 0 mg kinetin/lit môi trƣờng - CT2: Nền + 1,0 mg kinetin/lit môi trƣờng - CT3: Nền + 1,5 mg kinetin/lit môi trƣờng - CT4: Nền + 2,0 mg kinetin/lit môi trƣờng - CT5: Nền + 2,5 mg kinetin/lit môi trƣờng - CT6: Nền + 3,0 mg kinetin/lit môi trƣờng - CT7: Nền + 3,5 mg kinetin/lit môi trƣờng - CT8: Nền + 4,0 mg kinetin/lit môi trƣờng
Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng. bắt đầu theo dõi mẫu tái sinh chồi. Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ callus hình thành chồi xanh. + Tỷ lệ callus hình thành chồi bạch tạng. + Tỷ lệ callus chết
* Thí nghiệm 7:Nghiên cứu ảnh hưởng của chất BAP đến quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo.
Thí nghiệm gồm 8 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 5 lọ, mỗi lọ cấy10 mẫu. Mẫu cấy là những callus đạt tiêu chuẩn.
- CT1: Nền + 0 mg BAP/lit môi trƣờng - CT2: Nền + 1,0 mg BAP/lit môi trƣờng - CT3: Nền + 1,5 mg BAP/lit môi trƣờng - CT4: Nền + 2,0 mg BAP/lit môi trƣờng - CT5: Nền + 2,5 mg BAP /lit môi trƣờng - CT6: Nền + 3,0 mg BAP/lit môi trƣờng - CT7: Nền + 3,5 mg BAP/lit môi trƣờng - CT8: Nền + 4,0 mg BAP/lit môi trƣờng
(Môi trƣờng nền: N6 + 60g đƣờng +100mg inostol + 6,5 g agar/lit môi trƣờng)
Sau 20 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng thì theo dõi mẫu tái sinh chồi. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi và mẫu chết
* Thí nghiệm 8 : Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ từ chồi của mẫu cấy
Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 8 mẫu cấy. Mẫu cấy là những chồi có kích thƣớc đồng đều.
- CT1: Nền + 0. mg NAA /lit môi trƣờng - CT2: Nền + 0,1 mg NAA /lit môi trƣờng - CT3: Nền + 0,2 mg NAA /lit môi trƣờng - CT4: Nền + 0,3 mg NAA /lit môi trƣờng - CT5: Nền + 0,4 mg NAA /lit môi trƣờng - CT6: Nền + 0,5 mg NAA /lit môi trƣờng
(Nền: N6 + 60g đƣờng + 100mg inostol + 6,5g Agar/lit môi trƣờng) Sau 20 ngày cấy mẫu vào môi trƣờng tiến hành theo dõi mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng rễ hình thành, chiều dài rễ.
*Thí nghiệm 9 : Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường thuần dưỡng đến khả năng sinh trưởng của cây
Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thì theo dõi 4 mẫu cấy. Mẫu cấy là những cây lúa có kích thƣớc đồng đều.
- CT1: môi trƣờng Yoshida, - CT2: môi trƣờng MS - CT3: môi trƣờng Nƣớc cất - CT4: môi trƣờng đất.
Sau 20 ngày cấy bắt đầu theo dõi mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ sống, chết, chiều dài rễ, chiều cao cây, số lá, số nhánh.
4/ Đánh giá kết quả nuôi cấy trong phòng thí nghiệm a) Đánh giá kết quả khử trùng Sè mÉu sèng + Tû lÖ mÉu sèng (%) = x 100 Sè mÉu cÊy Sè mÉu chÕt + Tû lÖ mÉu chÕt (%) = x 100 Sè mÉu cÊy
b) Đánh giá khả năng ra mô sẹo
Sè mÉu t¹o m« sÑo
+ Tû lÖ mÉu t¹o m« sÑo (%) = x 100
Sè mÉu cÊy
c) Đánh giá khả năng tạo chồi
Sè mÉu t¹o chåi
+ Tû lÖ mÉu t¹o chåi (%) = x 100
Sè mÉu cÊy