Nguồn nấm
Nấm Metarhizium anisopliae với các dịng BDLA8, BDTN15, BXĐTV3,
BXDLA8, RBC-Q9-3, SCLLLA4, Ma2, Ma11, Ma13 được phân lập từ bọ dừa, bọ xít đen ở Long An, bọ dừa ở Tây Ninh, rầy bơng cúc ở quận 9, sâu cuốn lá lúa ở Long An, bọ xít đen ở Trà Vinh và chế phẩm Ma của Viện Luá Đồng Bằng Sơng Cửu Long (CP MA).
Thiết bị và vật tƣ
Các dụng cụ và vật tư cần thiết trong phịng thí nghiệm như que cấy, dụng cụ cắt thạch, mũi mác, bịch nylon, đĩa petri, bình tam giác, buồng đếm hồng cầu, tủ sấy, máy lắc, nồi hấp autoclave, cân phân tích, bếp điện, khay nhựa và các dụng cụ khác.
Các hố chất cần thiết như glucose, agar,… - Mơi trường nuơi cấy:
Mơi trường PGA (Potato Glucose Agar): Khoai tây: 200 g Agar: 15 g Đường:20 g Nước cất: 1000 ml Mơi trường lỏng: Bã bia: 20 g Glucose: 20 g Nước cất: 1000 ml Cĩ thể thay glucose bằng mật rỉ. - Mơi trường nhân giống
Mơi trường cơm
Qui trình lên men xốp nhân giống Metarhizium anisopliae
Cĩ thể sử dụng phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm vi sinh vật diệt sâu, cơn trùng cĩ hại từ vi nấm, trong đĩ sau khi bổ sung dịch dinh dưỡng vào các cơ chất khác nhau như bột đậu nành, bã đậu phụ, cám, gạo, lúa, mày ngơ,… người ta tiến
hành nhiễm giống nấm và cho lên men. Khi sinh khối nấm đạt cực đại tiến hành thu hồi sinh khối, xử lý và tạo sản phẩm chứa cả bào tử và hệ sợi nấm.
Sơ đồ 3.1 Qui trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm diệt sau và cơn trùng gây
hại
Tiến hành
- Chuẩn bị mơi trường: rửa sạch gạo, ngâm trong nước cất, để qua đêm. Sau đĩ hấp mơi trường ở 121oC trong 30 phút. Hai ngày sau hấp lại cũng ở 121o
C trong 30 phút. Để mơi trường qua 1 đêm rồi cấy nấm vào.
Mơi trường dịch thể, lắc 200 vịng/phút, nuơi to = 28 – 30oC
Mơi trường xốp trong bình 250 ml, nuơi 4 – 5 ngày ở to = 28 – 32oC
Mơi trường xốp trong chậu thủy tinh so sánh (khử trùng 100oC trong 30 – 40phút) + 10% giống. Nuơi 10 ngày ở to
C = 28 – 30oC. Độ ẩm khoảng 90 – 95%.
Làm khơ ở nhiệt độ phịng. Cĩ quạt. Độ ẩm 10% hoặc sấy ở 40o
C.
Nghiềm nhỏ. Đĩng bao nhãn. Kiểm tra chất lượng. Bảo quản ở 5 – 10oC trong tối và sử dụng.
- Chuẩn bị nấm: Nấm Metarhizium anisopliae 6 ngày sau khi cấy trên mơi
trường PGA, khi tảng nấm đã phát triển. - Cấy nấm
Nấm 6 ngày sau khi cấy trên mơi trường PGA từ đĩa petri được băm nhuyễn rồi cho vào bình tam giác chứa 75 ml mơi trường. Sau đĩ đem lắc 170 vịng/phút ở 28OC trong 3 ngày để chuẩn bị nhân nấm trên mơi trường xốp (mơi trường cơm).
Cho một ít mơi trường cơm đã chuẩn bị vào bịch nylon.
Hút 5ml dịch nấm trong bình tam giác cho vào mỗi bịch nylon, buộc kín miệng, xoi những lỗ nhỏ trên bịch nylon.
Khi nấm phủ xanh hết bề mặt, phơi khơ rồi sử dụng ray lọc bào tử nguyên chất ta được bột bào tử.
Tính bào tử nấm trong 1 g bột nấm: Pha 1 g bột nấm trong 10ml nước cất vơ trùng.
Cơng thức tính số lượng bào tử trong 1g bột nấm:
4000 x 1000 x a x 10-n D = b D: Số bào tử trong 1 g bột nấm. a: Số bào tử đếm được. n: Nồng độ pha lỗng.
b: Số ơ nhỏ của buồng đếm hồng cầu.