3.3.1 Phƣơng pháp khảo sát độc tính
Phương pháp 1: Bột bào tử nấm Metarhizium anisopliae với lượng khác nhau
được trộn đều trong đất. Sau đĩ thả sùng vào mơi trường và theo dõi.
Phương pháp 2: Pha bào tử thu được với nước đến nồng độ mong muốn. Sau
đĩ phun dung dịch nấm lên đất và lên sùng rồi theo dõi.
Phương pháp 3: Gây vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm nấm lên sùng theo
theo phương pháp 1 hoặc 2.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ chết.
3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Giai đoạn 1: Gây nhiễm sùng theo phương pháp 1 với các dịng BDTN 15, BDLA
8, BXĐTV 3, BXĐLA 8 và nghiệm thức đối chứng là sùng để nguyên.
Bảng 3.1 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 1
STT Nghiệm thức Số mẫu 1 BDTN 15 5 2 BDLA 8 5 3 BXĐTV 3 5 4 BXĐLA 8 5 5 Đối chứng 5
Giai đoạn 2: Gây nhiễm theo phương pháp 2 với các dịng MA 2, CP MA và 2
nghiệm thức đối chứng. Đối chứng 1 là mơi trường bã bia + mật rỉ, đối chứng 2 là nước.
Bảng 3.2 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 2
STT Nghiệm thức Số mẫu
7 MA 2 5
8 CP MA 5
9 Đối chứng 1 5 10 Đối chứng 2 5
Giai đoạn 3: Gây nhiễm theo phương pháp 3 với các dịng BDTN 15, BDLA 8,
BXĐTV 3, BXĐLA 8, SCLLLA 4, RBC – Q9 – 3, MA 11, MA 13 và nghiệm thức đối chứng là sùng gây vết thương.
Bảng 3.3 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 3 STT Nghiệm thức Số mẫu 11 BDTN 15 5 12 BDLA 8 5 13 BXĐTV 3 5 14 BXĐLA 8 5 15 SCLLLA 4 5 16 RBC – Q9 – 3 5 17 MA 11 5 18 MA 13 5 19 Đối chứng 5
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Giai đoạn nuơi sùng
Sùng được nuơi trong mỗi hộp nhựa riêng biệt và giữ ổn định trong ít nhất 2 tuần (Hình 4.1).
Hình 4.1 Sùng được nuơi trong điều kiện thí nghiệm
1. Hộp nhựa cĩ các kích thước: đường kính miệng hộp 12 cm; đường kính đáy 10cm, chiều cao 12 cm; 2. Sùng trắng tuổi 3 dài 3 cm; 3. hỗn hợp đất phân (mơi trường sống và nguồn thức ăn của sùng trắng).
Rồi từ sau 2 tuần nuơi ổn định trong phịng thí nghiệm mới cĩ thể cho gây nhiễm với nấm vì khoảng thời gian từ lúc đem mẫu sùng về nuơi đến lúc nuơi ổn định sùng cĩ thể chết vì nhiều nguyên nhân, cĩ thể chết do shock mơi trường, do nhiệt độ thay đổi, do độ ẩm khơng phù hợp hay do bị thương trong quá trình thu mẫu và vận chuyển về phịng thí nghiệm… Cũng cĩ thể chết trong lúc nuơi do mơi trường thiếu dinh dưỡng hoặc do khơng khéo léo trong khi thay mơi trường làm sùng bị thương. Nếu trong giai đoạn này đem gây nhiễm với nấm thì kết quả sẽ khơng chính xác. Do vậy ta cần nuơi sùng ổn định ít nhất 2 tuần để đảm bảo khi gây nhiễm sùng hồn tồn khỏe mạnh.
4.2 Giai đoạn nhân nấm
Nấm sau 6 ngày cấy trên đĩa petri (Hình 4.2a) được chuyển vào bình tam giác 250 ml chứa mơi trường bã bia + glucose + nước cất và lắc trong 3 ngày ở 28oC sẽ được nhân trên mơi trường xốp (Hình 4.2b).
3 1 2
a
Nấm M.anisopliae trên mơi trường PGA (potato glucose agar)
Nấm M.anisopliae trên mơi trường cơm
Hình 4.2 Hình thái nấm Metarhizium anisopliae trên mơi trường PGA
và trên mơi trường cơm
a. Nấm M.anisopliae trên mơi trường PGA sau 9 ngày cấy trên đĩa petri; b. Nấm M.anisopliae trên mơi trường cơm sau 9 – 11ngày nuơi cấy.
Số lượng bào tử của các dịng nấm M.anisopliae khác nhau là khác nhau. Nhờ buồng đếm hồng cầu, số lượng bào tử của các dịng nấm Metarhizium anisopliae
trong 1g bột nấm thu được từ mơi trường xốp (Bảng 4.1)
Phương pháp nhân nấm trên mơi trường xốp
Trong phương pháp nhân nấm, chúng tơi nhân nấm trên mơi trường lỏng rồi mới đưa sang mơi trường xốp. Trên thực tế chúng ta cĩ thể đưa thạch trực tiếp từ mơi trường thạch sang mơi trường xốp. Tuy nhiên thời gian để nấm mọc xanh hết bề mặt mơi trường rất lâu (khoảng 11 – 14 ngày) và tốn cơng cho nhiều lần băm thạch. Thêm vào đĩ do thời gian tiếp xúc với mơi trường khơng khí lâu (tốn thời
gian nhiều trong việc băm thạch) nên rất dễ nhiễm. Trong khi đĩ, nếu sử dụng sinh khối nấm từ mơi trường lỏng để nhân trên mơi trường xốp, thời gian để nấm lên xanh hết bề mặt mơi trường là 9 – 10 ngày và chỉ mất thời gian cho một lần băm thạch.
Bảng 4.1 Số lượng bào tử của các dịng nấm trong 1g bột nấm
Dịng nấm Số lượng bào tử trên 1 g Số lượng bào tử trên 1 ml BDTN 15 3,47 x 1010 BDLA 8 6,88 x 1010 BXĐTV 3 4,25 x 1010 BXĐLA 8 8,44 x 109 RBC – Q9 – 3 1,11 x 1010 SCLLLA 4 2,54 x 1010 MA 2 5 x 109 MA 11 5,47 x 109 MA 13 8,11 x 109 CP MA 5 x 109
Mặt khác, khi áp dụng phương pháp nhân nấm trên mơi trường xốp, ta cĩ thể thu được chế phẩm khơ (tức bột nấm) để thuận tiện cho quá trình gây nhiễm nấm theo phương pháp gây nhiễm khơ.
Mơi trường xốp được sử dụng là mơi trường cơm vì mơi trường cơm dễ dàng lọc bào tử tinh khơng chứa mơi trường. Nguyên nhân của cách làm này chính là để tránh hiện tượng sùng chết vì mơi trường xốp trong quá trình gây nhiễm.
So sánh với phương pháp nhân nấm trên mơi trường lỏng.
Như chúng ta đã biết, nhân nấm trong mơi trường lỏng cĩ ưu điểm là rất dễ làm, thời gian lên men ngắn, lượng nấm đưa vào rất ít trong khi lượng nấm thu được lại rất lớn và dễ phát hiện khi dung dịch nhiễm khuẩn (mơi trường nhiễm khuẩn bị đục) tuy nhiên chúng ta khơng thể sử dụng để gây nhiễm vì bào tử thu được là bào tử chồi nên thời gian lưu trữ ngắn, sức chống chịu kém dễ bị mất hoạt tính trong khi thời gian theo dõi sự nhiễm bệnh lại dài (21 ngày) trong khoảng thời
gian đĩ bào tử nấm cĩ thể đã mất hoạt tính hoặc đã chết trong mơi trường chứa hệ sinh vật đất.
Trong khi đĩ phương pháp lên men xốp nấm M.anisopliae mặc dù thời gian lên men dài nhưng hiệu quả lên men cao, lượng nấm đưa vào ít nhưng lượng nấm thu được là khổng lồ, nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền và rất dễ làm. Mặt khác, bào tử nấm thu được là bào tử đính nên cĩ thể lưu trữ lâu và khả năng chịu đựng mơi trường bất thuận tốt hơn. Do đĩ phù hợp với thí nghiệm gây nhiễm nấm phải theo dõi một thời gian dài tuy rằng trong quá trình nhân nấm phương pháp này cĩ một nhược điểm là khĩ kiểm sốt sự nhiễm tạp.
4.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae
4.3.1 Phƣơng pháp gây nhiễm 1 và 2
4 nghiệm thức ứng với 4dịng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8 cho gây nhiễm theo phương pháp 1 và nghiệm thức đối chứng (sùng để nguyên) được kết quả như sau:
Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng theo
phương pháp 1
Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết(ngày)
BDTN 15 0 _
BDLA 8 0 _
BXĐTV 3 0 _
BXĐLA 8 0 _
Đối chứng 0 _
Qua bảng 4.2, các nghiệm thức trên đều cho kết quả tỷ lệ sùng chết là 0%. Điều này đưa chúng tơi đến các giả định như sau:
Cĩ thể các dịng nấm M.anisopliae đem gây nhiễm khơng cĩ khả năng diệt
sùng trắng (hay cịn gọi là khơng cĩ độc tính). Nguyên nhân này rất hay gặp phải trong các nghiên cứu vì rất khĩ tìm được một dịng gây độc tính trên sùng trắng. Cũng cĩ thể phương pháp gây nhiễm chưa phù hợp, cĩ thể do nồng độ gây nhiễm chưa cao? Tuy nhiên nguyên nhân này khơng khơng thuyết phục vì nồng độ bào tử gây nhiễm là rất cao hoặc do khi gây nhiễm, nấm được trộn với đất, nấm cĩ thể bị
bị ức chế bởi các vi sinh vật đất? Nguyên nhân này cũng xảy ra nhưng khơng đáng kể. Một nguyên nhân nữa cũng cĩ thể xảy ra là lớp da của sùng quá dày khiến cho nấm khơng thể xâm nhập qua da để ký sinh và diệt sùng, trong trường hợp này thì cần hỗ trợ thêm chất làm bào mịn da của sùng thậm chí cĩ thể gây vết thương nhẹ giúp nấm dễ dàng xâm nhập vào cơ thể sùng, ký sinh và diệt sùng.
Với nhiều giả thuyết đưa ra trên, chúng tơi chú ý đến 2 nguyên nhân: một là các dịng trên khơng cĩ độc tính; hai là nguyên nhân do lớp da sùng quá dày, nấm khơng thể xâm nhập qua lớp da để ký sinh và diệt sùng. Do đĩ chúng tơi tiến hành gây nhiễm tiếp tục theo phương pháp 2 và phương pháp 3.
Thử nghiệm phương pháp gây nhiễm 2 đối với 2 dịng nấm MA 11, CP MA và theo đĩ 2 nghiệm thức đối chứng là mơi trường bã bia + mật rỉ + nước và nước.
Bảng 4.3 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương
pháp 2
Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết(ngày)
MA 2 0 _
CP MA 0 _
Đối chứng 1 0 _
Đối chứng 2 0 _
Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae theo phương pháp 2 cũng khơng khác gì so với phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết vẫn là 0% (Hình 4.3).
Với phương pháp 2 trên hai dịng nấm MA 2 và CP MA từ Viện Lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long, kết quả vẫn khơng khác biệt. Từ các kết quả trên, chúng tơi tiếp tục đặt ra giả thuyết các dịng nấm M.anisopliae này cĩ khả năng gây độc trên sùng trắng? Phương pháp gây nhiễm cĩ phù hợp? Và chúng tơi bắt đầu tiến hành gây nhiễm theo phương pháp gây nhiễm 3 (tạo vết thương nhẹ trước khi cho sùng tiếp xúc nấm).
Hình 4.3 Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước và phun mơi trường
bã bia + mật rỉ + nước
a.Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước: 5 mẫu sùng đều sống sau khi phun nước 21 ngày ; b. Nghiệm thức đối chứng sùng phun mơi trường bã bia + mật rỉ + nước: 5 mẫu sùng đều sống sau khi phun mơi trường bã bia + mật rỉ + nước 21 ngày.
Kết quả từ nghiệm thức đối chứng (hình 4.3) chứng tỏ sùng vẫn sinh trưởng bình thường khi phun nước và mơi trường bã bia + mật rỉ + nước. Điều này cho ta thấy rằng sự sinh trưởng và phát triển của sùng khơng bị ảnh hưởng bởi nước và mơi trường. Từ đây, cho ta lựa chọn nhiều hơn trong quá trình nhân nấm tạo chế phẩm diệt sùng thí dụ ta cĩ thể lựa chọn những mơi trường xốp khác cho số lượng bào tử nhiều hơn như mơi trường chứa cám, bột ngơ, đậu nành và trấu… Kết quả này cũng chứng minh cho kết quả thí nghiệm của chúng tơi là hồn tồn chính xác. Theo đĩ, khi gây nhiễm sùng với các dịng MA 2 và CP MA bằng phương pháp 2, sùng vẫn sinh trưởng bình thường. Cĩ nghĩa là theo phương pháp gây nhiễm 2, các dịng này khơng cĩ thể hiện độc tính trên sùng trắng. Tương tự như vậy, gây nhiễm các dịng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3 và BXĐLA 8 theo phương pháp 1 cũng khơng cĩ hiệu quả. Do đĩ, các dịng BDTN 15, BDLA 8,BXĐTV 3 và BXĐLA 8 cũng khơng thể hiện độc tính.
Hình 4.4 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm M.anisopliae BDTN 15,
BDLA 8, BXĐLA 8 theo phương pháp 1 và MA 11 và CP MA theo phương pháp 2
1. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm M.anisopliae BDTN 15 theo phương pháp 1 cho tỷ lệ sùng chết là 0%; 2. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm BDLA 8 theo phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết là 0%; 3. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm BXĐLA 8 theo phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết là 0%; 4. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm MA 2 theo phương pháp 2, tỷ lệ sùng chết là 0%; 5. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm CP MA theo phương pháp 2, tỷ lệ sùng chết là 0%.
1 2
3 4
4.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm 3
Sau khi tiến hành gây nhiễm trên phương pháp 1 và phương pháp 2 khơng cĩ kết quả. Chúng tơi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 3 được kết quả như sau:
Bảng 4.4 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương
pháp 3.
Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết (ngày)
BDTN 15 0 _ BDLA 8 0 _ BXĐTV 3 20 7 BXĐLA 8 0 _ SCLLLA 4 20 17 RBC – Q9 – 3 0 _ MA 11 80 5 – 17 MA 13 0 _ Đối chứng 0 _
Từ bảng 4.3, nghiệm thức BXĐTV 3, SCLLLA 4, MA 11 cho tỷ lệ sùng chết lần lượt là 20%, 20% và 80%. Kết quả này chứng tỏ lồi nấm này cĩ khả năng ký sinh và diệt sùng. Đặc biệt các dịng cĩ độc tính cao cĩ khả năng diệt sùng rất hiệu quả (dịng MA 11 cho tỷ lệ sùng chết là 80%). Như vậy ta hồn tồn cĩ thể khẳng định nấm Metarhizium anisopliae cĩ độc tính diệt sùng và cĩ thể sản xuất được chế phẩm nấm diệt sùng tuy nhiên cần phải nghiên cứu nhiều hơn nữa về các dịng nấm
M.anisopliae để tìm được dịng cĩ độc tính cao hơn.
Các dịng BDTN 15, BXĐLA 8, BDLA 8, RBC – Q9 – 3, MA 13 đều cho tỷ lệ sùng chết là 0%. Đặc biệt, đối chứng gây vết thương trong nghiệm thức đối chứng (Hình 4.5) vẫn sinh trưởng bình thường trong thời gian theo dõi (7 ngày, 14 ngày, 21 ngày) nên kết quả thí nghiệm của chúng tơi là chính xác. Thêm vào đĩ kết quả này cũng giúp chúng tơi chắc chắn hơn trong giả thuyết lớp da sùng quá dày khiến nấm khơng thể xâm nhập để ký sinh và diệt sùng. Như vậy trong phương pháp gây nhiễm 3 này các dịng BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 cũng khơng thể hiện độc tính của nấm trên sùng trắng.
Hình 4.5 Kết quả nghiệm thức đối chứng gây vết thương
Sùng được gây vết thương sau 21 ngày theo dõi, tỷ lệ sùng chết là 0%.
Kết quả phân lập nấm từ sùng nhiễm bệnh.
Các dịng cĩ tính độc trên sùng trắng MA 11, BXĐTV 3, SCLLLA 4 được chúng tơi phân lập lại để khẳng định chính xác kết quả thí nghiệm của chúng tơi (Hình 4.8). So với nấm Metarhizium anisopliae mà chúng tơi lấy tù ống nghiệm
gốc đem cấy trên đĩa petri, các nấm M.anisopliae mà chúng tơi phân lập từ sùng
nhiễm bệnh cĩ tốc độ sinh trưởng nhanh hơn biểu hiện ở thời gian gia tăng kích thước đường kính khuẩn lạc: thời gian đường kính khuẩn lạc nấm phân lập từ sùng nhiễm bệnh trên mơi trường PGA tăng đến 3 cm là 3 ngày trong khi thời gian là 5 ngày với nấm lấy từ ống gốc. Trong khi đĩ, hình thái nấm vẫn khơng hề thay đổi.
Hình 4.6 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm M.anisopliae BXĐTV 3,
SCLLLA 4 và MA 11 theo phương pháp 3.
1. 1/5 Sùng chết sau 7 ngày gây nhiễm với dịng nấm BXĐTV 3; 2. 1/5 Sùng chết sau 17 ngày gây nhiễm với dịng nấm SCLLLA 4; 3,4,5,6. 4/5 sùng chết khi gây nhiễm với nấm MA 11
N. Vùng nấm ký sinh trên sùng trắng. Vùng cĩ màu xanh là bào tử nấm đã hình thành. Vùng cĩ màu trắng là vùng sợi nấm đang phát triển.
4 N 3 N 5 N N 1 N 2 N 6
Hình 4.7 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm BDTN 15, BDLA 8,
BXĐLA 8, MA 13, RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3.
BDTN 15. Nghiệm thức BDTN 15, 5/5 Sùng khơng chết khi gây nhiễm với dịng nấm BDTN 15 theo phương pháp 3; BDLA 8. Nghiệm thức BDLA 8, 5/5 sùng khơng chết khi gây nhiễm với dịng nấm BDLA 8 theo phương pháp 3; BXĐLA 8. Nghiệm thức BXDLA 8, 5/5 sùng khơng chết khi gây nhiễm với dịng nấm BXĐLA 8 theo phương pháp 3; MA 13. Nghiệm thức MA 13, 5/5 sùng nhiễm khơng chết khi gây nhiễm với dịng nấm MA 13; RBC – Q9 – 3. Nghiệm thức RBC – Q9 – 3, 5/5 sùng khơng chết khi gây nhiễm dịng nấm RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3.
Hình 4.8 Kết quả phân lập nấm M.anisopliae từ sùng nhiễm
a. Nấm M. anisopliae sau 5 ngày cấy trên mơi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm MA 11; b. Nấm M.anisopliae sau 6 ngày cấy trên mơi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm BXĐTV 3; c. Nấm M.anisopliae sau 6 ngày cấy trên mơi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm SCLLLA 4.
4.3.3 Ảnh hƣởng của phƣơng pháp gây nhiễm nấm
So sánh nghiệm thức BXĐTV 3 khi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 1và