2. NĂNG SUẤT LIPID VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG LÊN SỰ
2.2.2. Yếu tố thành phần môi trƣờng
Hàm lƣợng lipid trong vi tảo có thể tăng lên dƣới các điều kiện nuôi cấy khác nhau nhƣ sự thiếu hụt nitrogen [34, 79, 42], cƣờng độ chiếu sáng mạnh [37], nhiệt độ thấp [62], nồng độ muối cao [78], và nồng độ sắt cao [44]. Dƣới các điều kiện kích thích, nhiều loài vi tảo có thể đáp ứng bằng cách gia tăng hàm lƣợng lipid, thông thƣờng từ 30% tới 60% (w/w) tế bào khô [14].
2.2.2.1. Thành phần Carbon
Cả hai loại nguồn carbon phi hữu cơ (CO2) lẫn carbon hữu cơ (glucose, acetate…) đều đƣợc vi tảo sử dụng để sản xuất lipid. Do vi tảo có khả năng sử dụng CO2 nhƣ nguồn carbon chính trong thành phần dinh dƣỡng nhờ vào khả năng quang hợp, con ngƣời hƣớng đến việc cô lập CO2 từ các nguồn khí thải để tận dụng cho quá trình quang hợp của vi tảo, một mặt giảm đƣợc chi phí trong quá trình nuôi cấy vi tảo, mặt khác là giảm thiểu CO2 trong không khí, đáp ứng nhiệm vụ cải thiện môi trƣờng và khắc phục hiện tƣợng nóng dần lên của trái đất do các loại khí nhà kính [12]. Theo ƣớc tính, để sản xuất đƣợc 100 tấn sinh khối vi tảo thì có khoảng 180 tấn CO2 đƣợc sử dụng trong quá trình quang hợp dƣới điều kiện ánh sáng tự nhiên hoặc nhân tạo [5].
Để việc sản xuất biodiesel và làm giảm CO2 trong không khí đạt hiệu quả, các loài vi tảo phải đƣợc chọn lựa thỏa mãn các yêu cầu: sinh trƣởng mạnh, hàm lƣợng lipid nhiều và có khả năng thích nghi tốt khi mức độ CO2 cao [12]. Khi khảo sát yếu tố nồng độ CO2 đối với mức độ sinh trƣởng và sự tích lũy lipid trên một số loài tảo đƣợc lựa chọn nhằm sản xuất lipid, Chan Yoo và các cộng sự đã đạt đƣợc một số kết luận nhƣ sau [12]:
Ba loài tảo Scenedesmus sp., Chlorella sp., và Botryococcus braunii
đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 10
C, chiếu sáng liên tục 150µmol/m2s trong 2 tuần. Để rút ngắn thời gian phase lag, vi tảo trƣớc đó đƣợc nuôi trong môi trƣờng sục không khí có 2% CO2 trong 1 tuần trƣớc khi cấy mẫu. Môi trƣờng nuôi cấy thực sự thì sử dụng không khí chứa 10% CO2 hoặc khí thải từ ống khói với vận tốc 0.3v/v/m, nồng độ CO2 là 5.5%.
- Đối với mức độ sinh trƣởng của tế bào khi nồng độ CO2 là 10%
Trong ba loài đƣợc khảo sát thì Scenedesmus sp. là loài đạt năng suất sinh khối cao nhất. Sinh khối tối đa đạt đƣợc là 3.13g/L vào ngày thứ 14, năng suất sinh khối đạt 217.50 ± 11.24 mg sinh khối khô/L.ngày. Trong một nghiên
20
cứu khác của Morais và Costa [51], đối với hai loài Chlorella sp. và
Scenedesmus sp. cô lập từ nhà máy nhiệt điện than đá, năng suất sinh khối của
chúng cũng khá cao khi nồng độ CO2 từ 6-12%. Năng suất tối đa của hai loài này với 6% CO2 lần lƣợt là 87 và 85mg sinh khối khô/L.ngày. Hơn nữa, hai loài tảo này cũng có thể sống trong môi trƣờng chứa CO2 với nồng độ lên tới 18%, và năng suất sinh khối cao nhất của loài Scenedesmus obliquus là 140mg sinh khối khô/L trong một ngày với nồng độ CO2 là 12% [50]. Qua đó thấy rằng, khi nuôi ở 10% CO2, năng suất sinh khối của Scenedesmus sp. cao
gấp 2-3 lần so với các nghiên cứu ở nồng độ khác, và cả ba loài tảo đƣợc khảo sát ở nồng độ CO2 này đều không gặp phải bất kỳ ảnh hƣởng xấu nào. Tuy nhiên, B. braunii lại có mức độ thích nghi chậm với nồng độ CO2 10%, do đó mức sinh trƣởng của loài này thấp hơn. Sục khí ở nồng độ cao hoặc sục khí liên tục CO2 2% sẽ làm giảm đáng kể pH của môi trƣờng [60]. Lee và các cộng sự [41] đã đề xuất rằng khi tăng mật độ tế bào ban đầu thì sẽ tăng đƣợc sức chịu dựng của vi tảo đối với nồng độ CO2 cao và giảm đƣợc thời gian thích nghi. Nhƣ vậy, nếu B. braunii đƣợc cho thích nghi với nồng độ CO2 thấp trƣớc đó, thì mức độ sinh trƣởng và sản lƣợng sinh khối sẽ có thể gia tăng mà không cần qua trải qua thời kỳ thích nghi [12].
- Đối với lipid và acid béo khi nồng độ CO2 là 10%
Hàm lƣợng lipid tổng trong vi tảo theo nghiên cứu của Chan Yoo và các cộng sự đạt từ 6.25% tới 25.79% khối lƣợng khô. Từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14, các giá trị có xu hƣớng giảm. Hàm lƣợng lipid trong Scenedesmus sp. thì thấp hơn so với B. braunii, nhƣng do Scenedesmus sp. có năng suất sinh khối cao nên có năng suất lipid tổng cao nhất trong ba loài khảo sát.
Bảng 2. 3: Năng suất sinh khối và năng suất lipid của Botryococcus braunii,
Chlorella vulgaris và Scenedesmus sp. khi nuôi ở 10% CO2 trong 14 ngày [12].
Loài Năng suất sinh khối (mg sinh khối khô/L.ngày)
Năng suất lipid tổng (mg/L.ngày)
B. braunii 26.55 ± 7.66 5.51 ± 1.53
C. vulgaris 104.76 ± 10.73 6.91 ± 0.03
Scenedesmus sp. 217.50 ± 11.24 20.65 ± 0.13
Trong khi hàm lƣợng lipid của cả hai loài Scenedesmus sp. và C. vulgaris đều thấp hơn 11.92%, hàm lƣợng lipid tổng của B. braunii vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 lần lƣợt là 25.79% và 21.10%. Các kết quả khác lại cho thấy
21
rằng, hàm lƣợng lipid tổng có thể đạt đƣợc từ 20-50% là khá phổ biến, thậm chí một số loài vi tảo có thể tích lũy lipid tới 80% (w/w) sinh khối khô. Và nuôi cấy trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau cũng có thể gia tăng đƣợc hàm lƣợng lipid tích lũy trong tế bào vi tảo [44]. Hàm lƣợng lipid tổng của B. braunii trong phase cân bằng sớm thì cao hơn trong phase sinh trƣởng theo hàm số mũ (phase log). Mặc dù hàm lƣợng lipid của cả ba loài tảo đƣợc Chan Yoo khảo sát với nồng độ 10% CO2 có thấp hơn một chút so với kết quả nghiên cứu trong các bản báo cáo khác, nhƣng chỉ xét trên phase cân bằng thì hàm lƣợng này lại cao hơn [12].
Bảng 2. 4: Thành phần các acid béo của Botryococcus braunii, Chlorella
vulgaris và Scenedesmus sp. khi nuôi cấy ở 10% CO2 trong 14 ngày [12].
Loài C16:0 (% w/w acid béo) C16:1 (% w/w acid béo) C18:0 (% w/w acid béo) C18:1 (% w/w acid béo) C18:2 (% w/w acid béo) B. braunii 29.5 ± 0.8 3.4 ± 0.3 1.0 ± 0.2 44.9 ± 0.4 21.2 ±0.4 C. vulgaris 24.0 ± 0.1 2.1 ± 0.0 1.3 ± 0.2 24.8 ± 1.5 47.8 ± 1.6 Scenedesmus sp. 36.3 ± 7.1 4.0 ± 0.8 2.7 ± 0.7 25.9 ± 4.5 31.1 ± 11.5
Trong số các acid béo, thì acid palmitic, acid oleic, acid linoleic đƣợc xem là thành phần chính với tỷ lệ từ 21% tới 45% tên tổng hàm lƣợng lipid trong ba loài tảo, các acid palmitoleic và acid stearic chỉ là thứ yếu, tỷ lệ chiếm rất thấp. Đặc biệt, acid oleic, là acid béo đƣợc xem nhƣ là thành phần chính và rất lý tƣởng để sản xuất biodiesel, thì lại chiếm tới 44.9% hàm lƣợng lipid tổng trong B. braunii [12]. Tỷ lệ này là rất cao khi so sánh với tỷ lệ acid oleic đạt đƣợc là 28% trong bản báo cáo của Ranga Rao và các cộng sự [60].
Vì vậy, có thể kết luận rằng, nồng độ CO2 10% là một nồng độ khá tối ƣu để nuôi cấy vi tảo thu lipid nhằm mục đích sản xuất biodiesel. Để khắc phục nhƣợc điểm hàm lƣợng lipid tổng hơi thấp, ta có thể sử dụng nồng độ 10% CO2 kết hợp với một số yếu tố dinh dƣỡng tối ƣu khác, vấn đề chính là ở nồng độ này có thể thu đƣợc thành phần lipid phù hợp cho yêu cầu sản xuất biodiesel chất lƣợng cao, nhất là trên một số chủng cụ thể đƣợc lựa chọn. Vấn đề sinh trƣởng chậm của một số loài nhƣ B. braunii, ta có thể áp dụng một số biện pháp cải thiện nhƣ tiền thích nghi giống với nồng độ CO2 thấp để rút ngắn thời gian thích nghi khi nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao.
22
- Khi nuôi bằng khí thải từ ống khói, nồng độ CO2 5.5%
Hai trong ba loài tảo nêu trên, B. braunii và Scenedesmus sp. đƣợc nuôi
ở hai chế độ để so sánh, đó là sục không khí và dùng khí thải từ ống khói có nồng độ CO2 là 5.5%. Năng suất sinh khối của B. braunii và Scenedesmus sp.
với khí thải từ nhà máy lần lƣợt là 77 và 203mg/L.ngày. Năng suất lipid của
B. braunii và Scenedesmus sp. đạt 21 và 39mg/L.ngày, tƣơng đƣơng với hàm lƣợng lipid là 24 và 18% [12]. Qua đó chứng tỏ rằng B. braunii vẫn giữ đƣợc hàm lƣợng lipid cao khi nuôi bằng khí thải nhƣ khi nuôi bằng khí chứa 10% CO2. Sinh khối và hàm lƣợng lipid trong các chủng Scenedesmus sp. thì tƣơng đƣơng khi nuôi ở 5% CO2 [66].
Thành phần acid béo của B. braunii và Scenedesmus sp. khi nuôi sục không khí và khí thải ống khói thì gần nhƣ không thay đổi, đặc trƣng cho mỗi loài. Tỷ lệ acid oleic trong B. braunii lần lƣợt là 56 và 59% lƣợng acid béo
tổng khi nuôi bằng không khí và khí thải. Vì vậy kết luận rằng có thể sử dụng khí thải từ ống khói để nuôi B.braunii nhằm sản xuất biodiesel vì có hàm
lƣợng lipid nhiều và trong đó thành phần acid oleic chiếm tỷ lệ rất cao [12].
2.2.2.2. Thành phần Nitrogen
Nitrogen là một yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến sự chuyển hóa và tích lũy lipid trong nhiều loài vi tảo. Thêm vào đó, điều khiển nồng độ nitrogen khá dễ dàng và đây là một yếu tố có chi phí thấp khi so sánh với các yếu tố khác [14]. Vì vậy, thành phần và hàm lƣợng nitrogen bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy vi tảo để tăng năng suất lipid đã đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu.
Nhƣ đối tƣợng Chlorella vulgaris, khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng cơ bản Bold, sử dụng CO2 có trong không khí (khoảng 300ppm) và NaNO3 là những nguồn cung cấp carbon và nitrogen duy nhất trong suốt quá trình thí nghiệm [5], nuôi cấy theo phƣơng thức quang tự dƣỡng trong 14 ngày dƣới ánh sáng liên tục có cƣờng độ 70µE/m2s, ở nhiệt độ 300C. Nồng độ nitrogen trung bình trong môi trƣờng nuôi cấy Chlorella vulgaris theo Guillard là
1.50g/L, do đó khi khảo sát sự giảm nồng độ nitrogen để kích thích sự tích lũy lipid, Attilio và các cộng sự đã nghiên cứu ở 2 nồng độ khác là 0.750 và 0.375g/L để so sánh với nồng độ trung bình [5]. Điều kiện hàm lƣợng nitrogen thấp trong môi trƣờng nuôi cấy thực sự làm gia tăng đáng kể sự tích lũy lipid trong vi tảo [34]. Vì vậy hàm lƣợng nitrate lần lƣợt đƣợc giảm đi còn ½ và ¼
23
so với nồng độ tiêu chuẩn trong khi cƣờng độ chiếu sáng và tốc độ sục khí vẫn giữ nguyên trong suốt các thí nghiệm. Ảnh hƣởng của việc giảm thiểu nồng độ NaNO3 trên sự sinh trƣởng của C. vulgaris đƣợc tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2. 5: Tham số sinh trƣởng và sự sản xuất lipid của C. vulgaris ở các
nồng độ NaNO3 khác nhau [5]
NaNO3(g/L) µ-Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (1/ngày)
Sản lƣợng lipid (glipid/100gsinh khối khô)
Năng suất lipid (mglipid/L.ngày)
1.500 0.14±0.00 5.90±0.42 8.16±0.65
0.750 0.14±0.01 14.37±0.64 20.44±0.75
0.375 0.14±0.00 15.31±0.51 20.30±0.40
Qua đó ta thấy, trong khi tốc độ sinh trƣởng riêng của C. vulgaris thay đổi không đáng kể thì hàm lƣợng lipid tăng gấp 3 lần khi giảm nồng độ nitrate từ 1.500g/L còn 0.375g/L.
Khi thay đổi nồng độ NaNO3, hàm lƣợng acid palmitic không thay đổi đáng kể [5]. Tuy nhiên, hàm lƣợng acid linolenic acid (C18:3) trong
C. vulgaris thì phù hợp với tiêu chuẩn biodiesel sử dụng cho các phƣơng tiện
vận chuyển ở Châu Âu (12%, mol/mol) [38].
Hình 2. 2: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME)
của C. vulgaris tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [A4]
(FAME: fatty acid methyl ester)
Tuy nhiên trong kỹ thuật nuôi cấy vi tảo, nguồn nitrogen có thể đƣợc sử dụng dƣới nhiều dạng khác nhau, nhƣ là ammonia, nitrate, nitrite và urea. Tùy
24
thuộc vào đặc tính loài, việc sử dụng các nguồn nitrogen khác nhau đem đến những hiệu quả khác nhau. Nhƣ đối với Ellipsoidion sp, sử dụng ammonium làm nguồn cung cấp nitrogen sẽ đem lại mức độ sinh trƣởng và hàm lƣợng lipid cao hơn khi sử dụng urea và nitrate [88]. Neochloris oleoabundans khi nuôi bằng nitrate sẽ sinh trƣởng nhanh hơn và tích lũy lipid nhiều hơn khi nuôi với urea [42], nhƣng tế bào lại sinh trƣởng yếu trong môi trƣờng sử dụng nguồn nitrogen là ammonium. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng cả ba loại nguồn nitrogen là nitrate, ammonium và urea đều có thể đáp ứng tốt đối với Spirulina platensis [16, 74]. Trong số các nguồn nitrogen hữu cơ, urea đóng một vai trò quan trọng và thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy vi tảo trên quy mô lớn bởi vì giá thành của urea thì thấp hơn nhiều khi so với các nguồn nitrogen khác [14].
Ngoài ra, chế độ nuôi cấy ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng và thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo. Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy fed-batch để điều chỉnh mức độ bổ sung môi trƣờng nhằm gia tăng năng suất [14]. Cải thiện năng suất lipid có thể thực hiện bằng biện pháp nuôi cấy fed-batch bổ sung gián đoạn nguồn nitrogen [79]. Thêm vào đó, trong phƣơng pháp nuôi cấy bán liên tục, nồng độ chất dinh dƣỡng ban đầu và mức độ khôi phục cũng đƣợc sử dụng để biến đổi các thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo [56, 22].
25