Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giai đoạn cuối pha log. Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh có trong dung dịch I và dung dịch II. DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào được loại ra nhờ dung dịch III. DNA plasmid được kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ ly tâm với tốc độ 12000 v/p.
Cấy một khuẩn lạc vào ống penicillin đã bổ sung 2 ml môi trường LB lỏng chứa kháng sinh thích hợp. Nuôi qua đêm ở 37°C trong điều kiện lắc 200 v/p.
Lưu ý:
Thể tích ống penicillin phải lớn gấp 4 lần thể tích nuôi cấy.
Các ống phải đậy nắp không chặt quá.
Dịch nuôi phải được nuôi cấy trong điều kiện lắc nhẹ.
Chuyển 1,5 ml dịch nuôi sang ống Eppendorf. Ly tâm ở 11000 v/p ở 4°C trong 30 giây. Loại bỏ dịch môi trường để thu cặn tế bào. Lưu giữ những dịch nuôi cấy chưa sử dụng hết ở 4°C.
Làm tan cặn tế bào trong 100 µl dung dịch Sol I (giữ trong đá) bằng máy vortex.
Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II (mới pha) vào mỗi Eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút. Không được vortex.
Bổ sung 150 µl dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ ở 0°C trong 3 – 5 phút.
Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 4°C và hút chuyển dịch sang ống mới.
Bổ sung một thể tích tương đương phenol : chloroform. Đảo lẫn hai pha bằng cách vortex và ly tâm ở 12000 v/p trong 2 phút ở 4°C. Hút chuyển pha trên sang ống mới.
Tủa nucleic acid bằng cách bổ sung 2 lần thể tích ethanol 98%. Trộn đều bằng vortex và giữ ở – 20°C trong 3 giờ.
Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 20 phút ở 4°C.
Loại sạch ethanol và bổ sung 1 ml ethanol 70%. Ly tâm thu tủa 12000 v/p trong 8 phút ở 4°C.
Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Hoà tan DNA trong 50 µl H2O khử in vô trùng (hoặc 50 µl TE pH 8) chứa 20 µg/ ml RNase.
Kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8 % và giữ mẫu ở – 20°C.
Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút để thu tủa tế bào.
Bổ sung 10% lyzozyme vào dịch Sol I, bổ sung 150 µl Sol I vào 1 ống ppendorf, đánh tan.
Bổ sung 150 µl Sol I, lắc đều + 150 µl Sol III, đảo đều, bổ sung 1 µl RNAse 1 mM/µl, ủ 37oC trong 1h, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu dịch.
Bổ sung 1ml EtOH 100%, ủ 3h, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu tủa, bổ sung 30 µl H2O.
Điện di 8 µl để kiểm tra DNA plasmid bằng agarose 0.8%