Nồng độ bào tử thích hợp để nuôi nhiễm với Agrobacterium khoảng 108 bào tử/ ml. Tế bào Agrobacterium đã được hoạt hóa trong môi trường IM lỏng có bổ sung AS. Nhờ sự có mặt của chất cảm ứng AS, các gen vir trở nên hoạt hóa, và quá trình chuyển gen vào nấm mốc được diễn ra dưới sự hỗ trợ của các gen vir. Bào tử nấm và tế bào Agrobacterium được nuôi nhiễm theo nhiều tỷ lệ khác nhau: 1: 1; 1: 3 và 1: 5. Hỗn hợp Agrobacterium và A. niger được trải đều lên màng lọc đã được đặt sẵn trên bề mặt của hai loại môi trường, môi trường IM đặc có bổ sung AS và môi trường IM đặc không bổ sung AS. Đĩa nuôi nhiễm được ủ ở 24 °C trong 3 ngày. Kết quả thu được rất khác nhau trên các đĩa nuôi nhiễm với tỷ lệ khác nhau. Ở đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1:1 và 1: 3 xuất hiện ít nấm, chúng phát triển không đều so với đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1: 5 (Hình 3. 18). Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), tỷ
lệ nuôi nhiễm giữa A. niger và Agrobacterium là 1 : 1 [9]; theo Sugui và các tác giả khác (2004), tỷ lệ nuôi nhiễm A. fumigatus và Agrobacterium là 1 : 10 [16].
Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37°C, bào tử nấm đã xuất hiện tương đối nhiều trên tất cả các đĩa nuôi cấy. Sự phát triển mạnh của bào tử nấm có thể do nồng độ bào tử nấm ban đầu bổ sung trong giai đoạn nuôi nhiễm quá cao, hoặc thời gian nuôi cấy quá dài và ở nhiệt độ cao. Điều này có thể khắc phục được bằng cách giảm nồng độ bào tử nấm nuôi nhiễm, giảm thời gian và nhiệt độ nuôi nhiễm [11].
Hình 3. 18: Kết quả nuôi nhiễm Agrobacterium và A. niger trên hai loại môi trường khác nhau
A: Môi trường IM có bổ sung AS B: Môi trường IM không bổ sung AS.
Đĩa nuôi nhiễm được nuôi ở 24°C trong 3 ngày kết quả thu được không cao. Nguyên nhân có thể do nhiệt độ và thời gian cho quá trình nuôi nhiễm chưa tối ưu. Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), điều kiện nuôi nhiễm giữa A. niger và
Agrobacterium là 2 ngày ở nhiệt độ phòng [9]. Theo Michielse và các tác giả khác
(2008), nhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm là từ 20°C – 25°C [11, 12]. Song, có thể nhiệt độ nuôi nhiễm khác nhau khi sử dụng các loài nấm khác nhau, chẳng hạn như, theo nghiên cứu của Sugui và các tác giả khác (2004), nhiệt độ tối ưu cho giai đoạn nuôi nhiễm Agrobacterium và A. awamori là 24°C trong 2 ngày [16].
A B B
Tỷ lệ bào tử nấm xuất hiện trên môi trường nuôi nhiễm có bổ sung AS mọc tốt hơn so với môi trường không bổ sung AS. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nhiều nghiên cứu về chuyển gen vào nấm nhờ Agrobacterium trên thế giới [9, 11, 12]. Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), AS ảnh hưởng rõ rệt lên hiệu suất nuôi nhiễm giữa A. niger và Agrobacterium. Trên môi trường chọn lọc thể chuyển gen đã không xuất hiện khuẩn lạc nào nếu trong giai đoạn nuôi nhiễm không được bổ sung thêm AS. Ngược lại, nếu giai đoạn nuôi nhiễm có bổ sung AS thì xuất hiện 5 - 6 khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh kháng hygromycin B [9]. Kết quả này cũng tương tự với kết quả của Wang và các tác giả khác (2008) khi nghiên cứu chuyển gen vào nấm P. digitatum thông qua Agrobacterium [17]. Theo nghiên Michielse và cs (2008), AS ảnh hưởng và cần thiết trong giai đoạn cùng nuôi, bởi nó cảm ứng gen vir chuyển T – DNA vào tế bào chủ, mặc dù AS không thật sự cần thiết trong giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu nuôi nhiễm [9, 11]. Mặc dù hiệu suất chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, tuy nhiên, rõ ràng có thể thấy AS làm giảm hiệu suất chuyển gen. Do vậy, bổ sung AS trong giai đoạn nuôi nhiễm là cần thiết để đạt hiệu suất chuyển gen cao nhất [9, 11, 12].
Khảo sát ảnh hưởng của màng lọc lên hiệu suất nuôi nhiễm, chúng tôi thử nghiệm hai loại màng lọc là cellulose và nitrocellulose. Kết quả là bảo tử đều mọc trên cả hai loại màng lọc, tuy nhiên chúng có sự phân bố khác nhau. Trên đĩa được sử dụng màng cellulose, nấm phát triển tốt hơn và mọc đều hơn trên khắp bề mặt giấy, trên đĩa được sử dụng màng nitrocellulose, nấm phát triển yếu hơn và thành từng cụm với màu đen sẫm so với đĩa nuôi nhiễm dùng màng cellulose. Qua kết quả nuôi nhiễm trên hai loại màng lọc, nuôi nhiễm trên màng cellulose nấm mọc tốt hơn so với màng nitrocellulose. Mặc dù màng lọc nitrocellulose được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi nhiễm với A. tumefaciens và nấm sợi [16], song trong một số nghiên cứu, hiệu suất chuyển gen rất thấp khi dùng màng nitrocellulose [12]. Không chỉ vậy, theo nghiên cứu của Sugui và các tác giả khác (2004), hiệu suất nuôi nhiễm trên màng nitrocellulose thấp hiệu suất nuôi nhiễm trên cellulose, chẳng hạn như nuôi nhiễm
Agrobacterium với A. fumigatus trên màng nitrocelluse đã không xuất hiện khuẩn lạc
nào [16]. Tuy nhiên, theo Michielse và các tác giả khác (2005), hiệu suất chuyển gen thấp hơn khi nuôi nhiễm trên màng nitrocellulose hoặc Hybon C, ví dụ như khi nuôi nhiễm Agrobacterium và A. infestans trên màng nitrocellulose, kết quả là không xuất hiện khuẩn lạc nào nhưng kết quả lại hoàn toàn ngược lại khi thay màng nitrocellulose bằng màng Nytran hoặc Hybon N+ [12]. Nguyên nhân của sự khác nhau trên đến nay vẫn chưa được biết rõ, song có thể thành phần hóa học của màng lọc ảnh hưởng đến sự phân bố và phát triển của Agrobacterium và bào tử nấm cũng như ức chế sự tương tác để vận chuyển T – DNA dẫn đến làm giảm hiệu suất chuyển gen [16].