- Ưu điểm:
+ Về mặt môi trường
Giảm lượng phát thải khí CO2, do đó giảm được lượng khí thải gây ra hiệu ứng nhà kính.
Không có hoặc chứa rật ít các hợp chất của lưu huỳnh (nhỏ hơn 0.001% so với đến 0.2% trong dầu Diesel)
Hàm lượng các hợp chất khác trong khói thải như: CO, SOx, HC chưa cháy, bồ hóng giảm đáng kể.
Không chứa HC thơm nên không gây ung thư
Có khả năng tự phân hủy và không độc (phân hủy nhanh hơn Diesel 4 lần, phân hủy từ 85% đến 88% trong nước sau 28 ngày)
Giảm ô nhiễm môi trường nước và đất Giảm tiêu dùng các sản phẩm dầu mỏ
+ Về mặt kỹ thuật
Có chỉ số cetan cao hơn diesel. Biodiesel rất linh động, có thể trộn với diesel theo bất kỳ tỉ lệ nào.
Biodiesel có điểm chớp cháy cao hơn Diesel, đốt cháy hoàn toàn, an toàn trong tồn chứa và sử dụng.
Có tính bôi trơn tốt. Ngày nay, để hạn chế lượng SOx thải ra không khí, người ta hạn chế tối đa lượng S trong dầu Diesel. Nhưng, chính những hợp chất lưu huỳnh lại
là những tác nhân giúp giảm ma sát của dầu Diesel. Do vậy, dầu Diesel có tính bôi trơn không tốt, đòi hỏi phải sử dụng thêm các chất phụ gia để tăng tính bôi trơn. Trong thành phần của biodiesel, có chứa Oxi, cũng có tác dụng giảm ma sát giống S.
Do có tính năng tương tự dầu Diesel, nên nhìn chung, khi sử dụng Biodiesel không cần cải thiện bất kỳ chi tiết nào của động cơ (riêng đối với hệ thống ống dẫn, bồn chứa làm bằng nhựa, ta phải thay bằng vật liệu kim loại).
+ Về mặt kinh tế
Sử dụng nhiên liệu Biodiesel ngoài vấn đề giải quyết ô nhiễm môi trường, nó còn thúc đẩy ngành nông nghiệp phát triển, tận dụng tiềm năng sẵn có của ngành nông nghiệp như dầu phế thải, mỡ động vật và các loại dầu khác ít có giá trị sử dụng trong thực phẩm.
Đồng thời, đa dạng hóa nền nông nghiệp và tăng thu nhập ở vùng nông thôn. Hạn chế nhập khẩu nhiên liệu Diesel
- Nhược điểm
Bên cạnh lợi ích của phát triển nhiên liệu sinh học, còn có không ít nguy cơ về môi trường, kinh tế và xã hội. Đây là hai mặt của một quá trình phát triển. Vấn đề là thúc đẩy lợi ích của nhiên liệu sinh học và hạn chế những nguy cơ.
+ Vấn đề lương thực:
Việc sử dụng đất để trồng cây nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học có thể ảnh hưởng đến nguồn cung cấp lương thực hoặc làm tăng giá lương thực, đặc biệt đối với các nước đang phát triển. Khi người nông dân thấy trồng cây nguyên liệu (như mía đường, cọ...) có lợi hơn trồng lúa, ngô, khoai, sắn, họ sẽ thôi cấy lúa, chuyển sang trồng mía, cọ để cung cấp cho các nhà máy và làm cho sản lượng lương thực giảm.
+ Ô nhiễm và cạn kiệt nguồn tài nguyên nước:
Nhiều loại cây nguyên liệu đòi hỏi rất nhiều nước trong quá trình sinh trưởng, vì vậy nếu trồng với số lượng quá lớn, diện tích quá rộng sẽ làm cạn kiệt các nguồn nước trong khu vực. Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan vinhoto, một chất được dùng để bón và tưới khi trồng mía đường cũng có thể gây ô nhiễm sông ngòi, kênh rạch và làm cho các loài thuỷ sinh không thể tồn tại. Năm 2003, người ta đã ghi nhận được một trường hợp bội nhiễm vihoto xảy ra tại Sao Paolo khiến cá chết hàng loạt trên suốt 95
+ Về mặt kỹ thuật
Biodiesel cung cấp năng lượng thấp hơn Diesel thông thường, vì vậy, nếu tỉ lệ Biodiesel cao, thì động cơ sẽ yếu hơn hoặc phải dùng nhiều nhiên liệu hơn mới đạt được công suất như khi dùng Diesel thông thường.
Biodiesel Oxi hóa nhanh hơn do đặc điểm thành phần hóa học, do đó khó có thể tích trữ loại nhiên liệu này lâu, đòi hỏi phải có thêm chất phụ gia.
Nhược điểm lớn nhất về mặt kỹ thuật là Biodiesel nguyên chất dễ bị đóng băng hoặc đặc lại trong thời thiết lạnh.
2.4.3.4. Những nguồn nguyên liệu để sản xuất Biodiesel ở Việt Nam
Ở nước ta, Biodiesel có thể được sản xuất từ một trong những nguồn sau:
- Dầu mỡ thải đã qua sử dụng: gồm các phế phẩm dầu mỡ đi từ các nhà máy chế biến dầu mỡ, dầu mỡ đã qua sử dụng được thu hồi sau quá trình rán, nấu từ các cơ sở chế biến thức ăn.
- Rỉ đường, ngũ cốc, vừng, lạc, dừa, mỡ cá Basa… (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cây Jatropha có nguồn gốc từ Trung M ỹ, di thực sang châu Phi, Ấn Độ và Nam Mỹ. Cây chịu được hạn, trồng ở đất khô cằn, có nhiều loại. Nước ta có thể tận dụng 9 triệu ha đất hoang hóa dọc ven các đường quốc lộ để trồng loại cây này.
- Vi tảo: một nguồn nguyên liệu triển vọng do sự phát triển đơn giản, vòng đời ngắn, năng suất cao, hệ số sử dụng năng lượng ánh sáng cao, thành phần sinh hóa dễ được điều khiển tùy điều kiện nuôi cấy và nhờ kĩ thuật di truyền, nuôi trồng đơn giản, thích hợp với quy mô công nghiệp. [1]
CHƯƠNG 3:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu và môi trường 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Giống tảo Tetraselmis được phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học, khoa sinh học, đại học Khoa Học Tự Nhiên cung cấp.
3.1.2. Địa điểm thí nghiệm
Phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học, khoa sinh học, Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh
Kiểm tra định tính dầu tảo tại viện Sinh Học Nhiệt Đới tp. HCM
3.1.3. Hóa chất
- Cồn 960
, Cồn 700
- Thuốc nhuộm Nile Blue 1% - Acid Acetic 8%
- Nước cất
- Nước biển tự nhiên - NaNO3 - NaH2PO4 - Na2SiO3.9H2O - FeCl3.6H2O - Na2EDTA.2H2O - CuSO4.5H2O - Na2MoO4.2H2O - ZnSO4.7H2O - CoCl2.6H2O - MnCl2.4H2O - ZnCl2 - (NH4)6Mo7O24.4H2O - H3BO3 - NaCl - Vitamin B12 - Biotin - Vitamin B1 3.1.4. Thiết bị - Nồi hấp khử trùng - Tủ cấy vô trùng - que cấy - đèn cồn - tủ sấy ển vi huỳnh quang - Kính hiển vi quang học - Cân phân tích
- chai nước biển 0.25l, 0.5L - Bình thủy tinh 1.5L
- Bơm sục khí
3.1.5. Môi trường
3.1.5.1. Môi trường F/2 (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975) [9]
Để chuẩn bị môi trường F/2 để nuôi vi tảo biển, bắt đầu với 950 ml nước biển tự nhiên, bổ sung các thành phần theo bảng, bổ sung NaCl để đạt độ mặn theo yêu cầu. Định mức bằng nước biển đến 1000ml. Hấp khử trùng.
Bảng 3.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường F/2
Thành phần Dung dịch gốc (stock) Hàm lượng
NaNO3 75 g/L dH2O 1 mL NaH2PO4 .H2O 5 g/L dH2O 1 mL Na2SiO3 .9H2O 30 g/L dH2O 1 mL
Dung dịch vi lượng (Bảng dưới) 1 mL
Dung dịch vitamin (Bảng dưới) 0.5 mL
- Dung dịch khoáng vi lượng môi trường F/2
Để chuẩn bị dung dịch khoáng vi lượng của môi trường F/2, bắt đầu với 950 ml nước cất, bổ sung các thành phần khoáng theo bảng, định mức đến 1000 ml bằng nước cất.
Bảng 3.2. Thành phần khoáng vi lượng đậm đặc của môi trường F/2 Thành phần Dung dịch gốc (stock) (g/L H2O) Hàm lượng FeCl3.6H2O --- 3.15 g Na2EDTA.2H2O --- 4.36 g CuSO4 .5H2O 9.8 1 mL Na2MoO4 .2H2O 6.3 1 mL 1 mL
CoCl2 .6H2O 10.0 1 mL (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MnCl2 .4H2O 180.0 1 mL
- Dung dịch vitamin của môi trường F/2
Chuẩn bị dung dịch vitamin cho môi trường F/2 , bắt đầu với 950ml nước cất vô trùng, bổ sung các loại vitamin theo hàm lượng của bảng, định mức đến 1000ml , bảo quản trong tủ lạnh hoặc tủ đá.
Bảng 3.3. Thành phần vitamin đậm đặc của môi trường F/2 Thành phần Dung dịch gốc (stock) (g/L H2O) Hàm lượng Thiamine HCl (vit. B1) --- 200 mg Biotin (vit. H) 0.1 10 mL Cyanocobalamin (vit. B12) 1.0 1 mL
3.1.5.2. Môi trường Walne (Walne PR, 1970) [16]
- Dung dịch stock khoáng vi lượng môi trường Walne
Bảng 3.4. Thành phần khoáng vi lượng đậm đặc môi trường Walne
STT Thành phần Hàm lượng (g/ 100ml) 1 ZnCl2 2.1 2 CoCl2.6H2O 2.0 3 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.9 4 CuSO4 .5H2O 2.0
Hòa tan lần lượt các muối vào 90ml nước cất, định mức đến 100ml. Do trong thành phần dung dịch có ZnCl2, làm đục môi trường, nên khi pha xong, ta nhỏ vào vài giọt acid HCl loãng để làm trong.
- Dung dịch stock vitamin môi trường Walne. [16]
Bảng 3.5. Thành phần vitamin đậm đặc môi trường Walne
STT Thành phần Hàm lượng
(pha cho 100ml)
1 Vitamin B12 10.0 mg
2 Vitamin B1 10.0 mg
3 Vitamin H (Biotin) 200.0 µg
Pha các vitamin vào 90ml nước cất vô trùng, sau đó định mức đến 100ml. Do Vitamin dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao nên dụng cụ phải được hấp khử trùng trước và thao tác trong môi trường vô trùng.
- Dung dịch stock dinh dưỡng môi trường Walne [16]
Bảng 3.6. Thành phần dinh dưỡng đậm đặc môi trường Walne
STT Thành phần Hàm lượng (Pha cho 1000ml) 1 FeCl3.6H2O 1.3 2 MnCl2 .4H2O 0.36 3 H3BO3 33.6 4 Na2EDTA.2H2O 45.0 5 NaH2PO4 .H2O 20.0 6 NaNO3 100.0 7 Khoáng Vi lượng 1ml
Pha lần lượt các chất dinh dưỡng vào 950ml nước cất, sau đó định mức thành 1000ml. Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút.
Bảng 3.7. Thành phần dinh dưỡng môi trường Walne [16]
STT Thành phần Hàm lượng
(ml/L)
1 Dung dịch dinh dưỡng 1 ml
2 Dung dịch vitamin 0.1 ml
Pha môi trường Walne trong 1000ml nước biển đã hấp khử trùng.
3.1.5.3. Môi trường Walne thương mại (Walne TM):
Cải tiến từ môi trường Walne, do công ty TNHH Công nghệ Hải Dương, tp. HCM sản xuất, được pha chế sẵn ở dạng hợp chất tinh thể.
Bảng 3.8. Thành phần dinh dưỡng môi trường Walne TM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Thành phần Hàm lượng (mg/L) 1 KNO 3 9.366 2 NaH 2PO4 .H2O 0.936 3 Na 2SiO3 0.936 4 H3BO3 1.5735 5 Na2EDTA.2H2O 2.1075 6 FeCl 3.6H2O 0.06 7 MnCl 2 .4H2O 0.0165 8 ZnCl2 0.0048 9 CoCl2.6H2O 0.00465 10 (NH 4)6Mo7O24.4H2O 0.00225 11 CoSO 4.5H2O 0.0045 12 Vitamin B 1 0.0375 13 Vitamin B 12 0.00225
3.1.5.4. Môi trường TT3
Môi trường đang được sử dụng tại trung tâm thủy sản 3 – Nha Trang.
Bảng 3.9. Thành phần môi trường TT3 STT Thành phần Hàm lượng (mg/L) 1 KNO3 70 2 KH2PO4 6 3 Na2SiO3 5 4 EDTA 5 5 Acid citric C6H8O7.H2O 7 6 FeCl3.6H2O 2
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm- Nguồn nước - Nguồn nước
Nguồn nước biển sử dụng cho nuôi cấy và giữ giống được lấy ở bãi sau biển Vũng Tàu. Nước biển được lọc qua giấy lọc, sau đó cho 200ml vào các bình nước biển thể tích 500ml. bổ sung khoáng và dinh dưỡng và hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 20 phút.
- Vệ sinh dụng cụ nuôi
ống nghiệm, bình nuôi cấy, bình giữ giống, pipet, đầu típ, xilanh, môi trường (trừ vitamin) đều được hấp khử trùng ở 1210
C, 1atm trong 20 phút.
3.2.2. Bố trí thí nghiệm
3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu.
Thí nghiệm được tiến hành trong bình nước biển 500ml với 4 môi trường nuôi: F/2, Walne, Walne TM, TT3 với 3 lần lặp lại. Tổng cộng số bình thí nghiệm là 12.
Điều kiện thí nghiệm
Ban đầu, quy trình khảo sát được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ ổn định khoảng 280C, chiếu sáng bằng ánh sáng đèn neon). Tuy nhiên, đây là điều kiện áp dụng cho quá trình giữ giống, ức chế quá trình sinh trưởng của tảo. nên trong 2 tuần đầu, mật độ tảo không đủ để thực hiện quá trình nhân giống phục
vụ thí nghiệm.Buộc phải chuyển toàn bộ thí nghiệm ra điều kiện tư nhiên. - Độ mặn: 10%
- Mật độ ban đầu: 230.000 tb/ml
- Cường độ sáng: khoảng 10.000 – 60.000 lux (có lưới che nắng). Chiếu sáng tự nhiên bằng ánh sáng mặt trời.
- Chu kỳ chiếu sáng: tự nhiên
- Nhiệt độ: ngoài trời, biên độ giao động nhiệt độ từ 280
C – 350C, chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm khoảng 70
C – 100C.
Mục đích: chọn được môi trường phù hợp cho tăng sinh của tảo Tetraselmis phục vụ cho công tác nghiên cứu và nuôi trồng đại trà.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nhân giống: giống ban đầu được cung cấp bởi phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học (khoảng 10ml) được chuyển toàn bộ vào 100ml môi trường F/2 đã hấp khử trùng. Tiến hành nuôi ở điều kiện tự nhiên trong 5 ngày, mật độ đạt được khoảng 230.000 tb/ml.
Chuyển 20ml dịch nuôi vào 180ml môi trường F/2, tiếp tục nuôi trong 5 ngày. Sau đó, chuyển toàn bộ 200ml dịch nuôi này vào bình chứa 800ml môi trường F/2. như vậy, lượng giống sau 15 ngày nuôi cấy đã đủ cho công tác lưu giữ giống và tiến hành thí nghiệm.
- Làm thuần:
Từ bình giống 1L, hút ra 200 ml chia đều cho 4 bình có chứa 50ml các môi trường: F/2, TT3, Walne, Walne TM. Tiến hành nuôi trong thời gian 7 ngày, như vậy, ta có 4 bình môi trường khác nhau (mỗi bình 100ml) để tiến hành thí nghiệm khảo sát môi trường tối ưu.
Mục đích của giai đoạn làm thuần này là giúp tảo thích nghi với điều kiện môi trường mới, tránh stress do thay đổi môi trường đột ngột.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị 4 lô thí nghiệm, mỗi lô là một môi trường khác nhau gồm 3 bình, mỗi bình 200ml.
Chuyển 20ml dịch nuôi đã làm thuần vào các môi trường tương ứng. Tiến hành nuôi ở điều kiện tự nhiên
- Chỉ tiêu theo dõi:
Mật độ tế bào, được theo dõi thông qua chỉ số độ hấp thu ánh sáng (OD) của dịch nuôi. Ghi nhận 2 ngày môt lần.
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Môi trường F/2
Môi trường TT3
Môi trường Walne
Môi trường Walne TM Lưu giữ giống gốc Nhân giống cấp I Làm thuần 20ml
3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Định tính lipid trong tảo
Thí nghiệm này được thực hiện tại viện sinh học nhiệt đới tp. HCM Tiến hành thí nghiệm:
Sau thí nghiệm 1, ta chọn được môi trường tăng trưởng tối ưu cho tảo
Tetraselmis, lấy mẫu dịch nuôi trong môi trường này để kiểm tra định tính lipid. Lắc đều dịch nuôi cấy, dùng pipet vô trùng hút 1ml vào eppendort 1.5ml
Thao tác trên ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy vòng chuyển vài giọt dịch nuôi cấy lên lam kính.
Cố định mẫu bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa (chú ý không để quá nóng sẽ làm vỡ hoặc teo tế bào)
Nhuộm bằng thuốc nhuộm Nile blue A Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Hình 3.3. Nhuộm mẫu tảo với Nile Blue A A. Nhuộm Nile Blue B. Sau khi rửa với acid acetic
3.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 3.3.1. Xác định mật độ tế bào
- Mẫu tảo được lấy 2 ngày một lần, một lần trong ngày vào lúc 10 giờ sáng
- Mật độ tế bào được xác định bằng hai phương pháp: + Buồng đếm hồng cầu hiệu Hirschmann của Đức Diện tích 1mm2,
độ sâu 0.1mm
+ Độ hấp thu ánh sáng của dung dịch tảo được xác định trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến (Spectrophotometer) CECIL – CE 1011.
Trên cơ sở đo độ hấp thu ánh sáng (OD) của các dung dịch mẫu với mật độ tảo khác nhau, xác lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa độ hấp thu ánh sáng và mật độ tảo (với bước sóng 660 nm). Từ đó có thể xác định nhanh mật độ của tảo thông qua đo OD.
3.3.2. Xác định độ mặn.
Độ mặn của nước biển được xác định bằng tỷ trong kế của Trung Quốc trước khi bố trí thí nghiệm nhằm xác định và bổ sung NaCl cho đạt theo yêu cầu.
Hình 3.6. Tỷ trọng kế
Hình 3.5.Máy đo OD
A. nhìn ngang B. Nhìn từ trên xuống
3.3.3. Phương pháp định tính Lipid
Định tính lipid bằng phương pháp phổ huỳnh quang nhờ thuốc nhuộm Nile blue. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Công thức phân tử: C20H20C1N30
Hình 3.7. Công thức Nile Blue A
A. Công thức hóa học B. Công thức không gian
Nguyên tắc: Nile blue là thuốc nhuộm huỳnh quang dùng để phân biệt chất béo trung tính từ các acid béo. Thuốc nhuộm này sẽ kết hợp với giọt dầu trong tế bào và phát xạ huỳnh quang màu cam đậm khi được kích thích bằng phổ huỳnh quang màu