b. Phƣơng pháp giữ giống
3.3.3.1. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme a Xác định hoạt tính cellulase [14], [25]
a. Xác định hoạt tính cellulase [14], [25]
Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thủy phân CMC (Sodium carboxymethyl cellulose) bằng enzyme ở nhiệt độ 40oC và pH 5,0.
Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, lượng đường khử này sẽ phản ứng với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid).
Sau đó tiến hành đo độ hấp thu OD của dung dịch đường bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
Cách thực hiện
Phản ứng enzyme Phản ứng thử không
Thêm 1 ml dung dịch CMC vào dung dịch mẫu
Lắc đều
Ổn nhiệt 40 0.1oC trong 10 phút
Thêm 4 ml dung dịch lactose – DNS
Lắc thật kỹ
Dùng nylon bịt kín miệng ống nghiệm Đặt trong nước sôi 15 phút
Làm nguội bằng nước lạnh
Tiến hành đo OD ( = 540 nm) (dùng nước cất làm đối chứng)
AT
Thêm 4 ml dung dịch lactose – DNS vào dung dịch mẫu
Lắc đều
Thêm 1 ml dung dịch CMC
Lắc đều
Dùng nylon bịt kín miệng ống nghiệm Đặt trong nước sôi 15 phút
Làm nguội bằng nước lạnh
Tiến hành đo OD ( = 540 nm) (dùng nước cất làm đối chứng)
AB
1 ml dung dịch mẫu ổn nhiệt 40 0.1oC trong 5 phút
Cơ chất CMC ổn nhiệt tương tự
1 ml dung dịch mẫu ổn nhiệt 40 0.1oC trong 5 phút
Cơ chất CMC ổn nhiệt tương tự
Dựng đƣờng chuẩn glucose
Pha dung dịch glucose 1 mg/ml bằng cách hòa tan 100 mg glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng dưới đây:
Bảng 3.1: Dựng đƣờng chuẩn glucose Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dung dịch glucose 1 mg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dung dịch CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - ml dung dịch lactose-DNS 4 4 4 4 4 4 4 - ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
Lắc đều các ống nghiệm này
Dán nylon lên miệng ống nghiệm Đun sôi cách thủy trong 15 phút
Làm lạnh về nhiệt độ phòng (bằng một chậu nước lạnh)
Đo độ hấp thụ OD ở bước sóng 540 nm AG Ống số 0 là ống đối chứng AW
Tính kết quả
Định nghĩa đơn vị hoạt tính
Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC với vận tốc 1 mol/phút dưới các điều kiện phản ứng.
Tính toán
Tính hệ số glucose
o Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn bằng hiệu số AG - AW
o Dựng đồ thị đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD), trục hoành là nồng dộ glucose (mg/ml).
Hệ số glucose được tính bằng công thức:
WG G G A A C F Trong đó: F: Hệ số glucose
CG: Nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) AG: Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn AW: Độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất
o Chia nồng độ (mg/ml) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch glucose chuẩn để thu được giá trị hệ số glucose, sau đó tính giá trị hệ số trung bình.
Xác định hoạt tính enzyme
Hoạt tính CMCase được tính theo công thức sau:
C 1 ml 1 1 phut 10 1 180 1000 F ) A (A (UI/g) CMCase T B Trong đó:
AT: Độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme AB: Độ hấp thu OD của phản ứng thử không
F: Hệ số glucose (mg/ml) 1000: Chuyển từ mg sang g
180: Trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ g sang mol 10 phút: Thời gian phản ứng
1 ml: Thể tích dung dịch enzyme C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml)