Khảo sát khả năng hình thành bào tử

3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử

Nguyên tắc

Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L .sporogenes chịu ảnh hƣởng lớn bởi những điều kiện môi trƣờng. Thí nghiệm sau đây đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng tạo bào tử. Đối tƣợng đƣợc lựa chọn để thực hiện thí nghiệm là 3 trong số các chủng giữ giống.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu 3 yếu tố Yếu tố 1: nhiệt độ nuôi cấy

Yếu tố 2: môi trƣờng nuôi cấy

Yếu tố 3: 3 chủng vi khuẩn L. sporogenes

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử L. sporogenes

Yếu tố 3 Yếu tố 1 Yếu tố 2 37⁰C/6 ngày [9] ³⁷ 0C/2 ngày  50⁰C/2 giờ  70⁰C/2 giờ

MRSA GYE MRSA GYE

Chủng

1 Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4

2 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 Nghiệm thức 7 Nghiệm thức 8

3 Nghiệm thức 9 Nghiệm thức 10 Nghiệm thức 11 Nghiệm thức 12

Chú ý: mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần

A = 0,009.n.100/V = 0,009.T A: khối lƣợng acid lactic (g) n : VNaOH 0,1N chuẩn độ (ml)

0,009 : hệ số chuyển 1 ml NaOH 0,1N sang số gam acid lactic

V : thể tích dịch sữa lên men chƣa lên men (ml)

Quy trình khảo sát

Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử

L. sporogenes [9, 40]

Chọn 3 chủng

Cấy tăng sinh trên GYE lỏng Ủ 370C/24 giờ

Hút 1ml sinh khối và cấy lên 2 môi trƣờng thạch đĩa

MRSA GYE

Ủ 370C/6 ngày _{Ủ 37}0C/2 ngày, Ủ 370C/6 ngày tiếp tục ủ ở 50⁰C/2 giờ và 70⁰C/2 giờ Ủ 370C/2 ngày, tiếp tục ủ ở 50⁰C/2 giờ và 70⁰C/2 giờ

Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a)

Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b)

So sánh số lƣợng bào tử và đánh giá khả năng hình thành bào tử

trong mỗi thí nghiệm bố trí Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b)

Ghi chú:

(a) xem phƣơng pháp thu sinh khối

(b) xem phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối

o Phƣơng pháp thu sinh khối

 Nguyên tắc

Nhằm đảm bảo thu một lƣợng sinh khối đồng đều giữa các đĩa, chúng tôi dùng cùng một lƣợng thể tích dung dịch để đồng nhất sinh khối và thu nhận một thể tích dịch sinh khối nhất định.

 Tiến hành

Hút 6 ml NaCl 9%0 vào mỗi đĩa. Dùng que cấy trang trộn đều sinh khối trên mặt thạch NaCl 9%0. Chuyển 4 ml dịch sinh khối vào ống nghiệm.

o Phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối [9,40]

 Nguyên tắc

Số lƣợng bào tử L. sporogenes trong sinh khối chỉ có thể đếm đƣợc sau khi đã pha loãng nhiều lần và cấy trang trên đĩa. Ngoài ra, để đánh giá chính xác số lƣợng bào tử trƣớc khi cấy trang, chúng tôi gia nhiệt những ống pha loãng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dƣỡng. Những bào tử còn sống sau quá trình gia nhiệt sẽ hồi sinh trở lại khi cấy trang. Vì vậy, số khuẩn lạc đặc trƣng thu nhận đƣợc cũng tƣơng ứng với số bào tử trong dịch pha loãng.

 Tiến hành

Từ sinh khối thu đƣợc, hút 1ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%0 để có nồng độ pha loãng 10-1. Hút tiếp 1 ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%0 để có nồng độ pha loãng 10^-2 . Tiếp tục nhƣ thế cho đến nồng độ pha loãng 10^-9 . Giữ 3 ống 10^-7 ,10^-8 , 10^-9 bồn nƣớc 100⁰C/10 phút. Hút 0,1 ml dịch khuẩn ở 3 nồng độ trên và trang trên 2 loại môi trƣờng thạch đĩa GYE và MRSA, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37⁰C/48 giờ. Đếm số lƣợng khuẩn lạc trong mỗi đĩa và tính số bào tử có trong sinh khối ban đầu.

 Tính kết quả

Công thức

Số khuẩn lạc trung bình trong 1 g hay 1 ml mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp khác nhau