3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Mẫu khảo sát
Chế phẩm sinh học (Thorne Research, USA)
3.2.2 Môi trƣờng
Môi trƣờng phân lập và giữ giống: GYE (Glucose Yeast Extract) thạch đĩa và thạch nghiêng
Môi trƣờng thử sinh hóa: GYE thạch nghiêng và lỏng, NB (Nutrient broth) bán lỏng, các môi trƣờng đƣờng
Môi trƣờng khảo sát bào tử: GYE và MRSA thạch đĩa. Môi trƣờng bảo quản: bột đậu nành sấy khô và glycerol
3.2.3. Hóa chất
Thuốc nhuộm Gram
NaCl 9%0 ; NaOH 0,1N; H2O2 30%; FeCl3 1N; phenol 1%
3.2.4. Thiết bị – dụng cụ
Thiết bị: tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp autoclave, bếp nấu, giá đỡ ống nghiệm... Dụng cụ: kính hiển vi, ống nghiệm, đĩa petri...
3.3. Nội dung đề tài
Phân lập các chủng L. sporogenes từ các chế phẩm có sẵn
Khảo sát khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc Khảo sát các điều kiện hình thành bào tử ở vi khuẩn L. sporogenes
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của
L. sporogenes
3.4.2. Phân lập vi khuẩn
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes
Lấy mẫu
Phân lập
Khảo sát
Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn Đặc điểm sinh hóa
Xác định khả năng tạo acid lactic Khảo sát hình thái
khuẩn lạc
Khả năng tạo bào tử
Nhuộm Gram (trực khuẩ n, Gram (+) ), sinh
bào tử ở mộ t đầ u. Kiểm tra phản ứng sinh hóa
Đánh giá Môi trƣờng GYE, 37oC/48 giờ
Môi trƣờng GYE để giữ giống
ở nhiệt độ phòng
3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào [9, 40]
Hình thái khuẩn lạc
Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa [9, 40]
Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, màu vàng trùng với màu môi trƣờng xung quanh. Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm.
Hình thái tế bào
Tế bào đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ lục 5.1). Vi khuẩn L. sporogenes có hình que, bắt màu Gram (+), không tạo chuỗi. Bào tử nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc tế bào: 0,4 – 0,8 µm 2,5 – 4,5 µm.
Hình thái bào tử
Bào tử đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ lục 5.2). Bào tử L. sporogenes có hình bầu dục, bắt màu hồng, nằm ở một đầu tế bào.
Kích thƣớc bào tử: 0,9 – 1,2 µm 1 – 1,7 µm. Mẫu chế phẩm
Pha loãng trong 9 ml NaCl 9%0 đến nồng độ 10-8
Giữ 3 ống nồng độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 ở 1000C/10 phút
Cấy trang trên đĩa GYE
Quan sát khuẩn lạc đặc trƣng Giữ giống trên GYE thạch nghiêng
3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa [35]
Để định danh L. sporogenes, ngoài hình thái khuẩn lạc và tế bào, còn cần đến những phản ứng sinh hóa đặc trƣng (xem phụ lục 6.1 – 6.3).
Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa [35] 3.4.3. Khả năng sinh acid lactic
3.4.3.1. Định tính
Nguyên tắc
Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phát hiện khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn L.
sporogenes bằng phản ứng với thuốc thử Uffelman
Tiến hành
Cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh vào 10 ml canh GYE. Ủ 370C/48 giờ. Ly tâm ống canh khuẩn ở tốc độ 3000 vòng/10 phút. Thu dịch nổi vào bình chiết, thêm 2,5 ml H2SO4 10%, 25 ml diethyl ether và lắc đều. Thu lấy tầng ether và cho bốc hơi thật kỹ trong bồn nƣớc nóng (trong khoảng 60 - 1000C)cho đến khi còn lại một thể tích dung dịch ổn định. Hòa tan phần còn lại này trong 2,5 ml nƣớc cất. Thêm vào 2,5 ml thuốc thử Uffelman màu tím xanh. Đọc kết quả.
Kết quả
Phản ứng (-): dung dịch không chuyển thành màu vàng Phản ứng (+): dung dịch chuyển thành màu vàng
Giống
Cấy tăng sinh trong GYE lỏng Ủ 370C/24 giờ Cấy sang các môi trƣờng thử
sinh hóa
3.4.3.2. Định lƣợng
Nguyên tắc
L. sporogenes lên men đƣờng tạo ra acid nên có cũng có khả năng làm đông vón sữa.
Dựa vào đặc điểm này, chúng tôi xác định và đánh giá lƣợng acid lactic (chiếm hơn 85% tổng lƣợng acid đƣợc tạo ra) do các chủng L. sporogenes trong chế phẩm Lactospore® sản xuất thông qua giá trị độ chua Therner.
Tiến hành
Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner
Công thức tính độ chua (T) trong 100 ml dịch sữa lên men
oTính lƣợng acid lactic
Công thức tính lƣợng acid lactic trong 100 ml dịch lên men dựa vào giá trị độ chua T = n.100/V T: độ chua
n: VNaOH 0,1N sử dụng (ml)
V: thể tích dịch sữa lên men chƣa pha loãng (ml) 4 ml GYE lỏng Hấp vô trùng Cấy vi khuẩn Ủ 370C/24 giờ Sữa đặc có đƣờng Pha loãng bằng nƣớc cất với tỉ lệ 1:10 Chiết 40 ml vào bình tam giác Ủ 370C/24 giờ Hút 10 ml dịch lên men + 90 ml nƣớc cất + 2-3 giọt phenolphtalein Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dịch lên men chuyển sang màu hồng nhạt
bền trong 5 phút Ghi nhận VNaOH 0,1N
Tính giá trị độ chua (T) theo công thức
3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử
Nguyên tắc
Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L .sporogenes chịu ảnh hƣởng lớn bởi những điều kiện môi trƣờng. Thí nghiệm sau đây đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng tạo bào tử. Đối tƣợng đƣợc lựa chọn để thực hiện thí nghiệm là 3 trong số các chủng giữ giống.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu 3 yếu tố Yếu tố 1: nhiệt độ nuôi cấy
Yếu tố 2: môi trƣờng nuôi cấy
Yếu tố 3: 3 chủng vi khuẩn L. sporogenes
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử L. sporogenes
Yếu tố 3 Yếu tố 1 Yếu tố 2 370C/6 ngày [9] 37 0C/2 ngày 500C/2 giờ 700C/2 giờ
MRSA GYE MRSA GYE
Chủng
1 Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4
2 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 Nghiệm thức 7 Nghiệm thức 8
3 Nghiệm thức 9 Nghiệm thức 10 Nghiệm thức 11 Nghiệm thức 12
Chú ý: mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần
A = 0,009.n.100/V = 0,009.T A: khối lƣợng acid lactic (g) n : VNaOH 0,1N chuẩn độ (ml)
0,009 : hệ số chuyển 1 ml NaOH 0,1N sang số gam acid lactic
V : thể tích dịch sữa lên men chƣa lên men (ml)
Quy trình khảo sát
Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử
L. sporogenes [9, 40]
Chọn 3 chủng
Cấy tăng sinh trên GYE lỏng Ủ 370C/24 giờ
Hút 1ml sinh khối và cấy lên 2 môi trƣờng thạch đĩa
MRSA GYE
Ủ 370C/6 ngày Ủ 370C/2 ngày, Ủ 370C/6 ngày tiếp tục ủ ở 500C/2 giờ và 700C/2 giờ Ủ 370C/2 ngày, tiếp tục ủ ở 500C/2 giờ và 700C/2 giờ
Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a)
Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b)
So sánh số lƣợng bào tử và đánh giá khả năng hình thành bào tử
trong mỗi thí nghiệm bố trí Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b)
Ghi chú:
(a) xem phƣơng pháp thu sinh khối
(b) xem phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối
o Phƣơng pháp thu sinh khối
Nguyên tắc
Nhằm đảm bảo thu một lƣợng sinh khối đồng đều giữa các đĩa, chúng tôi dùng cùng một lƣợng thể tích dung dịch để đồng nhất sinh khối và thu nhận một thể tích dịch sinh khối nhất định.
Tiến hành
Hút 6 ml NaCl 9%0 vào mỗi đĩa. Dùng que cấy trang trộn đều sinh khối trên mặt thạch NaCl 9%0. Chuyển 4 ml dịch sinh khối vào ống nghiệm.
o Phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối [9,40]
Nguyên tắc
Số lƣợng bào tử L. sporogenes trong sinh khối chỉ có thể đếm đƣợc sau khi đã pha loãng nhiều lần và cấy trang trên đĩa. Ngoài ra, để đánh giá chính xác số lƣợng bào tử trƣớc khi cấy trang, chúng tôi gia nhiệt những ống pha loãng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dƣỡng. Những bào tử còn sống sau quá trình gia nhiệt sẽ hồi sinh trở lại khi cấy trang. Vì vậy, số khuẩn lạc đặc trƣng thu nhận đƣợc cũng tƣơng ứng với số bào tử trong dịch pha loãng.
Tiến hành
Từ sinh khối thu đƣợc, hút 1ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%0 để có nồng độ pha loãng 10-1. Hút tiếp 1 ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%0 để có nồng độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục nhƣ thế cho đến nồng độ pha loãng 10-9 . Giữ 3 ống 10-7 ,10-8 , 10-9 bồn nƣớc 1000C/10 phút. Hút 0,1 ml dịch khuẩn ở 3 nồng độ trên và trang trên 2 loại môi trƣờng thạch đĩa GYE và MRSA, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C/48 giờ. Đếm số lƣợng khuẩn lạc trong mỗi đĩa và tính số bào tử có trong sinh khối ban đầu.
Tính kết quả
Công thức
Số khuẩn lạc trung bình trong 1 g hay 1 ml mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp khác nhau
3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 7.0 để so sánh số lƣợng bào tử khác nhau ở các điều kiện khảo sát
V 1 h 1 x N
X X: số lƣợng khuẩn lạc trong 1 g mẫu hay 1 ml
dịch mẫu
N: tổng số khuẩn lạc trong các đĩa cùng nồng độ pha loãng
x: số đĩa cùng nồng độ pha loãng h: nồng độ pha loãng (10-7, 10-8, 10-9) V: thể tích dịch mẫu cấy trên 1 đĩa (ml)
3 X X X
Y 1 2 3 Y: số khuẩn lạc trung bình ở các nồng độ pha loãng
X1, X2, X3: số lƣợng khuẩn lạc trung bình có trong 1 g hay 1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.4. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 4.4.1. Kết quả phân lập
Từ chế phẩm, chúng tôi phân lập đƣợc 20 chủng L. sporogenes (xem Bảng 4.1)
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes
Số khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc chọn
Khuẩn lạc có hình thái vi/đại thể phù hợp với L. sporogenes
Khuẩn lạc có sinh hóa phù hợp với L. sporogenes
20 Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%)
20 100% 20 100%
Vì 100% khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc chọn đều có hình thái vi thể và đặc điểm sinh hóa phù hợp với L. sporogenes nên chúng tôi kết luận trong chế phẩm của Thorne Research (USA) chỉ thuần một loại vi khuẩn L. sporogenes.
4.4.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes 4.4.2.1. Quan sát khuẩn lạc
Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GYE ở 370C/48 giờ. Chúng tôi quan sát đƣợc hình dạng khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, lồi, đều, màu vàng, bề mặt mịn; đƣờng kính khuẩn lạc trung bình 2 – 3 mm; vùng môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu tím sang màu vàng.
4.4.2.2. Quan sát hình thái tế bào
Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram khuẩn lạc điển hình phân lập đƣợc trên môi trƣờng thạch GYE sau 48 giờ ủ ở 370C. Vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần (100X). Hình thái của tế bào vi khuẩn đƣợc chúng tôi ghi nhận nhƣ sau: hình que, bắt màu Gram (+), 2 đầu hơi tròn, không tạo chuỗi; kích thƣớc tế bào 0,4 – 0,8 µm 2,1 – 4,5 µm; bào tử nằm về một đầu tế bào (xem Hình 4.2).
4.4.2.3. Quan sát hình thái bào tử
Chúng tôi tiến hành nhuộm bào tử từ mẫu khuẩn lạc điển hình trên môi trƣờng GYE sau 72 giờ ủ ở 370C. Bào tử quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần có những đặc điểm sau: hình bầu dục; phình to ở một đầu tế bào; bắt màu hồng; kích thƣớc 1 – 1,2 µm 1,2 – 1,8 µm.
4.4.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes
Từ 20 chủng L. sporogenes phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành thử phản ứng sinh hóa. Kết quả ghi nhận đƣợc trình bày qua bảng 4.2
Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần
Bảng 4.2: Đặc đi ểm si nh hóa c ủa các c hủng L. sporoge nes p hân lậ p đƣợc t ừ chế phẩm Glucose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Sucrose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Fructose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Mannito l + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Maltose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Lactose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Sorbitol + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Dextrin + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Sinh hóa Chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Qua Bảng 4.2, chúng tôi nhận thấy đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập phù hợp với tính chất sinh hóa của vi khuẩn L. sporogenes.
4.5. Khả năng sinh acid lactic 4.5.1. Định tính
Từ 20 chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định khả năng sinh acid lactic của chúng. Kết quả ghi nhận đƣợc trình bày ở Bảng 4.3.
Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa
Số chủng thử
nghiệm Số chủng có khả năng sinh acid lactic
20 Số lƣợng Tỷ lệ (%)
20 100
Dựa vào Bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy 20 chủng phân lập đƣợc đều có khả năng sinh acid lactic. Để đánh giá thêm về lƣợng acid lactic do L. sporogenes sản xuất, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm đo độ chua Therner và định lƣợng acid lactic.
4.5.2. Định lƣợng
Sau khi thực hiện nuôi cấy các chủng L. sporogenes phânlập đƣợc trong môi trƣờng sữa đặc có đƣờng, chúng tôi nhận thấy: tất cả 20 chủng đều có khả năng làm đông vón sữa. Từ giá trị độ chua thu nhận đƣợc, chúng tôi tính đƣợc lƣợng acid lactic do các chủng
L. sporogenes sản xuất. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 4.4.
Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất
Chủng Thể tích NaOH 0.1N
cần dùng (ml) Độ Therner (T)
Số gam acid lactic trong 100ml dịch lên men (g/100ml)
Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes
Ghi chú:
ĐC (-): 2,5ml nƣớc cất + 2,5 ml thuốc thử Uffelman
ĐC (+): 2,5ml acid lactic 96% + 2,5 ml thuốc thử Uffelman
1 2,4 24 0,216 2 2 20 0,18 3 2,9 29 0,261 4 2 20 0,18 5 1,9 19 0,171 6 2 20 0,18 7 2 20 0,18 8 2,2 22 0,198 9 1,9 19 0,171 10 2,5 25 0,225 11 2 20 0,18 12 1,9 19 0,171 13 2,1 21 0,189 14 2 20 0,18 15 1,6 16 0,144 16 3 30 0,27 17 1,7 17 0,153 18 1,8 18 0,162 19 3,8 38 0,342 20 3,2 32 0,288
Qua bảng 4.4, chúng tôi nhận thấy độ Therner biến động từ 1,6 - 3,8 tƣơng ứng với lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sinh ra là 0,144 - 0,342 g/100ml. Loài Lactobacillus khác nhƣ L. bulgaricus sản xuất đƣợc 0,684 g acid lactic/100 ml dịch sữa
10% đƣợc lên men ở 370C/5 giờ [1]. Nhƣ vậy, 20 chủng vi khuẩn L. sporogenes chúng tôi đang khảo sát có khả năng sinh acid lactic nhƣng yếu hơn những loài Lactobacillus khác. Nguyên nhân của điều này có thể vì điều kiện nuôi cấy hay lên men chƣa phù hợp hay vì đặc tính di truyền của các chủng L. sporogenes đang khảo sát. Ngoài ra, chúng tôi không tìm thấy một tài liệu nào ghi nhận rõ ràng về lƣợng acid lactic mà vi khuẩn L. sporogenes sinh ra.
Trong 20 chủng khảo sát, chúng tôi nhận thấy 3 chủng 16, 19, 20 có khả năng sản xuất acid lactic mạnh nhất. Khả năng tạo acid lactic có ý nghĩa nhất định trong việc ứng dụng vi khuẩn L. sporogenes làm chế phẩm. Acid lactic giúp vi khuẩn L. sporogenes ức
chế những vi khuẩn gây bệnh trong đƣờng ruột vật chủ và mang những lợi ích về mặt sinh lý cho vật chủ (xem mục 2.2.5.1. phần 2). Vì vậy, chúng tôi chọn 3 chủng 16, 19, 20 để tiếp tục khảo sát khả năng tạo bào tử, từ đó có thể khảo sát tiếp sự tồn tại của bào tử khi trộn vào chế phẩm.
4.6. Khảo sát khả năng hình thành bào tử
Sau khi khảo sát trên 2 loại môi trƣờng, 2 điều kiện nhiệt độ - thời gian hình thành bào tử
