- Đôi nét về phản ứng chuỗi PCR:
Sau đây là những nét chung nhất của kỹ thuật PCR: Nguyên tắc cơ bản của PCR:
Nguyên tắc cơ bản của PCR:
+ Khái quát chung:
PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được thiết kế thì chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm
PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94oC và như vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này đã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus ) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc độ xúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại 755oC. Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5oC trong 230 phút hoặc 40 phút tại 95oC. Như vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng.