- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
Phương pháp 2 Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN
Giới thiệu chung:
Phương pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự ADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cách tiện ích nhất.
Điều quan trọng nhất là các bản kính phải được rửa sạch tuyệt đối.
1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nước nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tương đương. Sau đó rửa sạch lại bằng nước.
2, Rửa các bản kính với nước trao đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay Scott Utinity để lau cho sạch không tạo vết. Kiểm tra lại bụi bám vào kính để lau cho sạch, sau đó kính được lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, Gel Slick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất này là giúp cho việc đổ gel dễ dàng hơn và gel không bị dính vào các bản kính.
3, Rửa lại bản đệm cách gel (spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đối xứng của bản kính.
4, Ghép hai bản kính với nhau. Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau sao cho hai bản spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với hai bản kính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị chảy gel trong quá trình đổ gel. Kẹp 2 cạnh của gel tại 3 vị trí.
5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig). Trộn đều hỗn dịch:
16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50%. 5 ml 10X TBE
Đưa đến thể tích 100 ml với nước
Cho vào 800 μl 10% Ammonium persulphat. 50 μl TEMED.
Quá trình polyme hóa được thực hiện trong 15 -20 phút.
Chạy gel LR trong dải nhiệt độ 50-55oC, nhiệt độ cao hơn 55oC sẽ phá các liên kết acrylamid LR gel là dạng cải biến cho gel acrylamid có một số ưu điểm sau: Thứ nhất là LR gel với nồng độ cao hơn nhưng việc chạy gel thì cũng như gel có nồng độ thấp thông thường, ví dụ LR gel 5% tương đương 4% gel acrylamid với bisacrylamid Thứ 2 là LR gel có khả năng phân giải cao hơn và chạy với tốc độ nhanh hơn 30-40% gel thông thường, gel LR khô nhanh hơn và không bị dính.