- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger:
Sanger:
Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADN polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự của ADN được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho xác định trình tự sợi ADN đơn tạo ra bằng cách tách dòng ADN vào vectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi tách dòng ADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự ADN cho nghiên cứu phân loại và xác định typ vi sinh vật thay cho phương pháp hóa học.
Một số lợi thế của phương pháp này ở chỗ: Phương pháp này đơn giản và không tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương pháp này ở chỗ các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự ADN. Tuy nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR.
+ Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger:
Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang).
- Phương pháp truyền thống:
Các bước chính cho giải trình tự ADN như sau: Chuẩn bị ADN khuôn
Bắt cặp ADN khuôn và mồi
Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN
Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid biến tính với urea. Đọc kết quả.
Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau: 1. Chuẩn bị ADN khuôn. 2. Điều kiện bắt cặp mồi.
3. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN. 4. Tách sản phẩm trên acrylamid gel.
5. Đọc kết quả.