- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
Một số chú ý khi thao tác::
a. Trộn gel nhẹ nhàng (tránh trộn mạnh).
b. Hút dịch acrylamid bằng pitpet hay có thể dùng cốc đong.
c. Đặt bản kính nghiêng 15o và đổ gel bằng cốc đong hay pipet. Kiểm soát tốc độ đổ gel bằng góc nghiêng. Tránh để dòng gel khi đổ ngắt quãng vì điều này sẽ dẫn đến tạo bọt. Nếu phải dừng lại để hút dịch mới vào syringer thì lúc đó phải hạ dần bản kính xuống vị trí nằm ngang trước khi dừng đổ gel. Sau đó lấy dịch gel mới vào syringer và tiếp tục đổ gel trước khi gel lên khỏi vị trí nằm ngang. Cứ thao tác như vậy đến khi đổ đầy bản gel.
Nếu xuất hiện bọt khi đổ gel thì phải dừng lại ngay và nghiêng tấm kính để cho bọt khí đi lên, có thể gõ nhẹ tay vào bản kính để cho bọt khí đi lên hết. Phải loại hết bọt khí ra khỏi gel, sau đó mới tiếp tục đổ gel.
6, Đặt gel nằm ngang và đưa cạnh bằng của lược răng cá mập vào gel, tạo một góc hơi nghiêng nhằm tránh tạo bọt khí. Chắc chắn rằng đã đặt cạnh bằng của lược vào phía trên của gel và phần răng cá mập sẽ nằm dọc theo đỉnh của bản kính dài (lược sẽ nằm ngược với vị trí trong hình 1.10). Bổ sung thêm gel và đẩy thêm lược vào đúng vị trí và cố định lược lại bằng kẹp để tránh xê dịch.
7, Bao bọc gel với giấy nilon SaranWrap để tránh gel tiếp xúc với không khí. Ngoài ra có thể thấm giấy lọc với đệm TBE để đậy lên. Điều này giữ cho gel luôn ẩm và tránh gel tiếp xúc với oxy (oxy làm cản trở quá trình polyme hóa).
8, Quá trình polyme xảy ra từ 30 phút đến 1 giờ. Để xác định polyme hóa có thể hút một ít gel vào pipét pastuer và để cho đến khi quá trình polyme hóa xảy ra. Hoặc có thể lấy gel cho vào ống falcon và đậy chặt nắp lại, trong nhiều trường hợp thì gel chỉ nên polyme hóa trong 15-20 phút hoặc nhanh hơn. Nếu quá trình polyme hóa không xảy ra thì lại phải tiến hành rửa kính và đổ lại gel. Chú ý nhiều khả năng quá trình polyme hóa không xảy ra do Ammonium persulphat không còn tốt khi dùng lâu, nên chuẩn bị
dịch này để dùng trong tuần. Điều cần chú ý nữa là gel phải được bọc kỹ với SaranWrap để qua đêm.
9, Chuẩn bị gel trước khi chạy: a. Lấy SaranWrap ra khỏi gel.
b. Đặt gel vào thiết bị điện di (bản kính dài đặt áp vào thiết bị), chắc chắn là đã cắt bỏ lớp băng dính ở đáy gel để việc điện di xảy ra.
c. Đổ 0,5X TBE vào bể đệm dưới của thiết bị, lượng đệm cần phải đủ để cho bản gel nằm trong đệm.
d. Đổ đệm vào bể trên của thiết bị, đảm bảo gel nằm dưới lớp đệm. Kiểm tra xem đệm có bị chảy ra hay không.
e. Chạy thử 20-30 phút tại hiệu điện thế 2000V (phải cẩn thận vì rất nguy hiểm), sau đó nhiệt độ của bản gel nên đạt tới 50oC.
10, Xử lý nhiệt với các mẫu ADN điện di tại 85oC trong 5 hút và trộn đều, để trên đá cho đến khi lên mẫu.
11, Tắt nguồn điện vào thiết bị điện di (nhớ ngắt nguồn điện vào thiết bị trong bất kỳ trường hợp nào khi thao tác với thiết bị).
12, Trong khi xử lý nhiệt với các mẫu thì rửa bề mặt với đệm trong bể điện di, dùng pipet hay syringer 60 ml. Mục đích của thao tác này là loại lớp urea trên bề mặt gel.
13, Đánh dấu vị trí đỉnh của mặt gel trên bản kính trước của gel.
14, Đặt lược răng cá mập lên mặt gel, các răng được đặt trên mặt gel và ngập sâu vào mặt gel khoảng 1 mm. Chắc chắn là vùng không gian giữa các răng được giới hạn giữa các răng và gel. Như vậy phần lược răng cá mập trở thành các cạnh bên của giếng, bề mặt gel là đáy của giếng tra mẫu (hình 1.10).
Hình 1.10. Vị trí đặt lược sau khi đổ gel.
Phải đảm bảo chắc chắn đã làm sạch bề mặt gel trước khi đặt lược răng cá mập lên trên gel. Nếu không thực hiện việc này sẽ không đọc được phần kết quả phía trên của gel. Nếu quyên thực hiện bước này có thể rửa sạch
từng giếng tra mẫu nhưng việc này sẽ khó khăn hơn. Nếu lên nhiều mẫu thì trước đó cần phải phải làm sạch giếng vì urea sẽ khuyếch tán và tích tụ tại bề mặt gel tại thời điểm lên mẫu.
15, Việc xử lý nhiệt ở 85oC đối với các mẫu điện di nhằm làm biến tính ADN, chỉ lên khoảng 2-4 ml mẫu cho mỗi giếng (lên mẫu theo thứ tự ACGT), có thể dùng bút để viết lên kính nhằm tránh nhầm lẫn.
16, Quá trình điện di với hiệu điện thế 2000V cho đến khi màu BPB (Bromophenolblue) di chuyển đến tận cùng bảng gel (1-2 giờ). Nếu chạy gel có gradient muối sẽ cho phép đọc được nhiều base hơn trên một gel do việc làm ngắn lại khoảng cách giữa các băng ADN ở phần cuối bản gel. Nên dừng điện di từ 45 phút – 1 giờ. Tắt nguồn điện, bổ sung 1/2 thể tích 3M NaOAc vào bể đệm đáy, trộn đều. Lại tiếp tục công việc chạy gel cho đến khi BPB di chuyển đến cuối bản gel. Chú ý sự có mặt của muối nồng độ cao sẽ dẫn đến nhiệt độ tăng, do đó cần phải kiểm soát nhiệt độ của quá trình chạy gel nhằm tránh vỡ kính và hỏng gel.
Chuẩn bị gel cho phát hiện bằng ảnh phóng xạ.
17, Lấy bản gel ra khỏi thiết bị, chú ý bể đệm đáy chứa chất phóng xạ, các nucleotid dư sẽ đi ra khỏi bản gel.
18, Đổ bỏ bể đệm trên.
19, Đặt bản gel trên bàn thí nghiệm sao cho tấm kính ngắn lên trên. Phủ lên một lớp SaranWrap, dùng đá lạnh đặt lên trên khoảng 2 phút để cho gel co lại, dùng thanh nhựa tách các lớp kính ra, giữ nguyên không cho tấm kính trên tiếp xúc lại với gel vì như vậy gel sẽ dính và bị vỡ. Lúc này gel sẽ chỉ dính vào tấm kính dưới không có silicon được phủ khi đổ gel. 20, Đặt tấm giấy Whatman lên trên gel và vuốt đều nhẹ nhàng, lúc đó gel sẽ dính vào giấy và có thể lấy ra dễ dàng (Chú ý trong trường hợp sử dụng chất phóng xạ là S35 thì nên cố định mẫu theo cách dưới đây).
21, Sau khi lấy gel ra hỏi tấm kính đáy thì bọc gel với SaranWrap, chú ý tránh không khí đi vào giữa lớp SaranWrap và gel, điều này sẽ cản trở ảnh phóng xạ trên phim.
22, Có thể đưa vào thiết bị sấy gel.