6.2.1 Đặc điểm chung về cấu trỳc và chức năng
Đõy là thụ thể gồm bảy chuỗi xoắn xuyờn màng cú chức năng tiếp nhận hormon tham gia hoạt hoỏ adenylate cyclase thụng qua cơ chế kết hợp với protein G. Epinephrine (adrenalin) khởi động quỏ trỡnh hoạt hoỏ adenylate cyclase bằng cỏch gắn vào thụ thể β- adrenergic, là một protein cú kớch thước 64 kDa nằm xuyờn bảy lần ngang qua màng sinh chất của cỏc tế bào đớch (hỡnh 6.1).
Hỡnh 6.1
Mụ hỡnh thụ thể β-adrenergic (theo Gross J. và cộng sự. 1996)
Vựng đầu N của thụ thểβ-adrenergic, giống như rhodopsin, cú chứa cỏc oligosacarid liờn kết vào vị trớ N và nằm ở phớa ngoài của màng tế bào. Vựng đầu C cú chứa Serine và Threonine được phosphoryl hoỏ thuận nghịch, định vị trong vựng nội bào. Giống như ỏnh sỏng tỏc động lờn quang thụ thể chứa retinal, khi epinephrine liờn kết với thụ thể nằm trong hốc gắn kết với hormon ở trờn màng tế bào sẽ tạo ra khả năng dịch chuyển của receptor tiếp cận với protein G để hoạt hoỏ protein này. Khi protein G được hoạt hoỏ sẽ tiếp cận với enzym adenylate cyclase nằm trong màng tế bào tạo ra phản ứng biến đổi ATP thành AMP vũng. Quỏ trỡnh này được minh hoạở sơđồ hỡnh 6.2.
Vị trí liên kết chất truyền tin Vùng dịch ngoại bào màng tế bào Mảnh t−ơng tác với protein G Vùng dịch nội bào
Protein G điều khiển adenylate cyclase được gọi là protein kớch thớch (Gs). Gs đó kớch thớch adenylate cyclase như thế nào? Alfred Gilman đó tinh sạch Gs và thấy rằng nú cú chứa cỏc tiểu đơn vịα (45kDa), β (35kDa) và γ (97kDa). Trong đú tiểu phần α cú hoạt tớnh GTPase (cú thể liờn kết và thuỷ phõn GTP); cũn β và γ sẽ tạo phức βγ giữ cho protein G bỏm trờn bề mặt tế bào ở phớa tế bào chất.
Giống như transducin một protein truyền và khuếch đại tớn hiệu ỏnh sỏng trong cơ chế nhỡn, Gs cú sự chuyển hoỏ giữa dạng GTP hoạt hoỏ adenylate cyclase và dạng liờn kết G với GDP (G - GDP) thỡ khụng hoạt hoỏ adenylate cyclase. Khi khụng cú mặt của hormon thỡ gần như toàn bộ Gs đều ở dạng G - GDP bất hoạt. Sự liờn kết của cỏc hormon vào thụ thể sẽ khởi động cho sự liờn kết của GTP vào protein G thay thế cho GDP: phức hợp thụ thể-hormon liờn kết vào protein G, cảm ứng sự giải phúng GDP đó được liờn kết và cho phộp GTP thế chõn liờn kết vào tiểu đơn vịα. Tiểu phần α cú mang GTP (Gsα-GTP) được tỏch ra từ tiểu đơn vịβγ (Gβγ) sẽ hoạt hoỏ adenylate cyclase. Do vậy dũng thụng tin xuất phỏt từ phức hợp thụ thể-hormon tới Gs rồi tới adenylate cyclase (hỡnh 6.2).
Hỡnh 6.2
Sự hoạt hoỏ adenylate cyclase nhờ tớn hiệu hormon liờn kết với thụ thể (theo Horton và CS. 1994).
Khi một hormon được gắn vào thụ thể sẽ làm cho nhiều Gsαđược tạo thành, tạo ra sự trả lời kớch thớch được khuếch đại. Sự hoạt hoỏ adenylate cyclase nhờ epinephrine và sự hoạt hoỏ cGMP phosphodiesterase nhờ rhodopsin đó được quang hoạt hoỏ là hai quỏ trỡnh cú cơ chế giống nhau. Gs và transducin là cỏc thành viờn của một họ cỏc protein mang hai chức năng tớn hiệu.
ngoại bào
Sự hoạt hoỏ adenylate cyclase dừng lại như thế nào? Transducin cú cơ chế dựa trờn sự khử hoạt tớnh. Tương tự như vậy, Gs cú hoạt tớnh GTPase. GTP khi đó liờn kết vào tiểu đơn vịα của Gs sẽ bị thuỷ phõn trong một khoảng thời gian rất ngắn thành GDP. Tuy nhiờn sự thuỷ phõn của GTP được gắn vào Gs là cần thiết nhưng khụng đầy đủ cho việc khử hoạt tớnh của adenylate cyclase. Sơđồ cỏc vựng hoạt động chức năng của Gs được trỡnh bày ở hỡnh 6.3. Hỡnh 6.3 Sơđồ vựng hoạt động chức năng của Gs (theo Strosberg và CS. 1996)
Phức hệ thụ thể-hormon cũng cần được làm mất hoạt tớnh nhờ quỏ trỡnh phosphoryl hoỏ để trở về trạng thỏi khụng bị kớch thớch. Cũng giống như Rhodopsin kinase, β- adrenergic receptor kinase sẽ tạo ra phosphoryl hoỏ vựng đầu C của phức hệ thụ thể- hormon chứ khụng tỏc động vào thụ thể khi thụ thể khụng được kết hợp với hormon. Cuối cựng, sự liờn kết của β-arrestin, một đồng phõn của arresin vừng mạc, sẽ bao phủ lờn thụ thểđó bị phosphoryl hoỏ, làm giảm khả năng kớch thớch cho sự hoạt hoỏ Gs của nú.
Túm lại tớn hiệu thụng tin thứ nhất (hormon) sau khi được nhận biết bởi cỏc thụ thể bảy chuỗi xoắn xuyờn màng sẽ được truyền đến protein G theo cỏc con đường khỏc nhau và sẽđược tế bào trả lời khỏc nhau. Hầu hết cỏc thụ thể hormon nối protein G hoạt hoỏ cho một chuỗi cỏc phản ứng làm thay đổi nồng độ của cỏc chất phõn tử nhỏ đúng vai trũ là chất truyền tin thứ hai trong tế bào, thường gặp nhất là cAMP và ion Ca++.
6.2.2 AMP vũng - chất truyền tin thứ hai trong hoạt động của nhiều hormon
Những nghiờn cứu đầu tiờn của Earl Sutherland trong thập niờn 1950 đó đưa đến một tiến bộ lớn trong nhận thức của chỳng ta về việc cỏc hormon hoạt động như thế nào ở mức độ phõn tử. Mục đớch trước tiờn là xỏc định epinephrine (một catechol-amin bắt nguồn từ Tyrosine) và glucagon (một peptit cú 29 acid amin) đúng vai trũ là những tớn hiệu phõn giải glycogen, một dạng dự trữ của glucose ở cơ thểđộng vật xảy ra như thế nào. ễng đó phỏt hiện ra rằng cỏc hormon này liờn kết với cỏc thụ thể bề mặt tế bào, khởi đầu cho sự hỡnh thành của AMP vũng (cAMP) – một nucleotit nhỏ bắt nguồn từ ATP. Bản thõn cỏc hormon khụng xõm nhập vào tế bào sống mà tất cả cỏc ảnh hưởng của chỳng đến tế bào đều được thực hiện thụng qua cAMP. Như vậy, hormon đúng vai trũ là chất truyền tin thứ nhất (từ tế bào này đến tế bào khỏc) cũn cAMP đúng vai trũ là chất truyền tin thứ hai (bờn trong một tế bào).
CAMP được tổng hợp nhờ chu trỡnh biến đổi ATP: trong đú cú vai trũ của adenylate cyclase (hỡnh 6.4).
Hỡnh 6.4
Sự tổng hợp và phõn giải cAMP nhờ cỏc enzym
Nhúm 3’OH của đường ribose gắn vào nhúm α-phosphoryl của AMP để tạo ra một liờn kết 3’, 5’ phosphodieste, cựng với việc giải phúng của pyrophosphate. Adenylate cyclase là một protein màng cú kớch thước 120 kDa với nhiều đoạn chuyển màng, xỳc tỏc cho phản ứng nội phõn tử đú. Quỏ trỡnh tổng hợp cAMP, cũng giống như cGMP, là phản ứng thu nhiệt nhẹ (ΔG0’= +1,6 kcal/mol). Năng lượng được sinh ra là do sự thuỷ phõn tiếp theo của pyrophosphate dưới sự xỳc tỏc của pyrophosphatase. Sự thuỷ phõn của cả cAMP và cGMP đều là những phản ứng toả nhiệt lớn (ΔG0’= −12 kcal/mol).
Người ta đó sử dụng nhiều tiờu chuẩn thớ nghiệm để xỏc định xem cAMP cú đúng vai trũ như một chất truyền tin thứ hai trong hoạt động của một loại hormon cụ thể hay khụng.
1. Adenylate cyclase trong một tế bào đớch sẽ được kớch thớch bởi cỏc hormon tỏc động lờn thụ thể tế bào đú. Hoạt tớnh cyclase củacỏc tế bào khụng đỏp ứng sẽ khụng được kớch thớch khi khụng bổ sung hormon.
2. Sự thay đổi nồng độ cAMP trong tế bào đớch sẽ xảy ra trước hoặc cựng thời điểm cuối cựng của sự kớch thớch hormon. Sự thay đổi về lượng hormon sẽ dẫn tới sự thay đổi về nồng độ cAMP.
3. Cỏc chất ức chế phosphodiesterase cú thể hoạt động cựng với cỏc hormon làm cho cAMP như một chất truyền tin thứ hai.
4. Sự bổ sung cAMP hoặc một chất tương tự vào cỏc tế bào đớch cũng cú hiệu quả sinh học tương tự như của hormon. Thực tế cAMP khụng được sử dụng theo cỏch này vỡ lượng cAMP xõm nhập vào tế bào là rất ớt. Tuy nhiờn cỏc dẫn xuất ớt phõn cực của cAMP như dibutyryl cAMP lại cú khả năng thấm vào tế bào, thuỷ phõn cỏc liờn kết este và giải phúng cAMP.
Cỏc thớ nghiệm dựa trờn cỏc tiờu chuẩn đú đó cho thấy cAMP là một chất truyền tin thứ hai cho rất nhiều loại hormon như epinephrine và glucagon và nhiều loại khỏc (bảng 6.1).
Bảng 6.1
Cỏc hormon sử dụng cAMP như một chất truyền tin thứ hai
STT Cỏc hormon sử dụng cAMP như một chất truyền tin thứ hai 1Canx itonin 2 Chorionic gonadotropin 3 Corticotropin 4Epin ephri ne(a
dren aline) 5Cỏc horm on kớch thớch bao noón 6Gluc agon 7 Lipotropin 8Cỏc hor mon tạo thể vàn g 9Cỏc horm on kớch thớch cỏc tế bào tạo sắc tố đen 10 Norepinephrine (noradrenaline) 11Cỏc horm on tuyến cận giỏp
12 Cỏc hormon kớch thớch tuyến giỏp 13 Vasopressin
Như vậy cAMP cú ảnh hưởng rất lớn đến nhiều quỏ trỡnh diễn ra trong tế bào. Vớ dụ: nú phõn giải cỏc nhiờn liệu dự trữ, tăng sự bài tiết của cỏc acid ở màng dạ dày, dẫn đến sự
phõn tỏn của cỏc hạt sắc tốđen, làm giảm sự ngưng kết tiểu cầu, gõy ra sự mở của cỏc kờnh ion Cl-.
6.2.3 CAMP kớch thớch sự phosphoryl hoỏ của nhiều protein đớch bởi protein kinase kinase
cAMP ảnh hưởng như thế nào đến cỏc quỏ trỡnh diễn ra trong tế bào? Hầu hết sựảnh hưởng của cAMP tới tế bào sinh vật nhõn chuẩn được thực hiện thụng qua sự hoạt hoỏ của một protein kinase duy nhất là protein kinase A (PKA). PKA cú 2 chuỗi điều hoà (R) và 2 chuỗi xỳc tỏc (C). Khi khụng cú mặt cAMP thỡ phức hệ R2C2 ở trạng thỏi bất hoạt. Sự liờn kết của cAMP vào chuỗi R sẽ làm giải phúng chuỗi C, phần cú hoạt tớnh enzym lờn chớnh nú. PKA được hoạt hoỏ sau đú sẽ phosphoryl hoỏ gốc Serine và Threonine đặc hiệu nhiều protein ở tế bào đớch để làm thay đổi hoạt tớnh của chỳng. Một vài vớ dụ minh hoạ cho điều này là:
1. Trong quỏ trỡnh trao đổi glycogen: sự phosphoryl hoỏ của hai enzyme nhờ PKA đó dẫn đến sự phõn giải của glycogen và ức chế sự tổng hợp của glycogen.
2. Cỏc tế bào biểu mụ cú chứa kờnh ion Cl- gọi là CFTR. Kờnh này được mở nhờ sự phosphoryl hoỏ một nhõn tố đó được hoạt hoỏ dưới sự xỳc tỏc của PKA ở vựng điều hoà CFTR.
3. PKA kớch thớch sự biểu hiện gen đặc hiệu bằng cỏch phosphoryl hoỏ một nhõn tố hoạt hoỏ quỏ trỡnh phiờn mó được gọi là protein liờn kết với nhõn tố đỏp ứng của cAMP (CREB).
4. Sự truyền qua synap giữa hai nơron thần kinh ở ốc sờn biển Aplysia được tăng cường bởi serotonin - một chất dẫn truyền thần kinh được giải phúng bởi cỏc tế bào bờn cạnh. Serotonin liờn kết vào thụ thểđể khởi động cho quỏ trỡnh hoạt hoỏ adenylate cyclase. Nồng độ cAMP tăng lờn sẽ hoạt hoỏ PKA, khi PKA được hoạt hoỏ sẽ phosphoryl hoỏ kờnh K+ và làm cho chỳng đúng lại. Việc đúng cỏc kờnh K+ sẽ làm tăng sự kớch thớch của cỏc tế bào đớch.
6.2.4 Protein G, tỏc nhõn điều khiển quan trọng cho cỏc tớn hiệu qua màng
Bề mặt tế bào được bao bọc bởi hàng trăm cỏc tớn hiệu hoỏ - lý hoạt hoỏ cho cỏc thụ thể liờn kết với màng. Cỏc thụ thể đó được hoạt hoỏ sẽ khởi động một dũng thụng tin truyền qua vị trớ của cỏc protein cặp đụi. Đú chớnh là protein G. Nú được gọi như vậy vỡ nú liờn kết với cỏc nucleotit Guanine là GDP và GTP. Chỳng cú dạng heterotrime (vỡ chỳng được cấu tạo từ ba loại tiểu đơn vị khỏc nhau) và liờn kết với:
• Bề mặt bờn trong của màng plasma.
• Cỏc thụ thể nhận biết xuyờn màng của cỏc hormon, được gọi là cỏc thụ thể liờn kết với protein G (GPCRs).
• Ba tiểu đơn vị tạo ra protein G là: Gα mang vị trớ gắn nucleotit, cú ớt nhất 20 loại Gα khỏc nhau được tỡm thấy trong cỏc tế bào động vật cú vỳ. Tiểu đơn vị Gβ và Gγ.
6.2.4.1 Cơ chế hoạt động của protein G
Protein G tồn tại ở dạng hoạt động sẽ gắn với GTP và dạng khụng hoạt động thỡ gắn với GDP.
Cỏc tiểu đơn vị α liờn kết với GTP và thuỷ phõn GTP thành GDP. Tất cả cỏc dạng đồng phõn của tiểu đơn vịαđều là GTPase, mặc dự tỷ lệ thực của quỏ trỡnh thuỷ phõn GTP là khỏc nhau từ dạng này sang dạng khỏc (Carty et al., 1990; Linder et al., 1990). Khi GDP liờn kết với tiểu đơn vị α, chỳng sẽ kết hợp với βγ để tạo thành dạng heterotrimer khụng hoạt động. Phõn tử protein G dạng này cũng cú khả năng liờn hợp với một thụ thể khụng hoạt động. Khi cú mặt của cỏc chất kớch thớch, thụ thể sẽ bị hoạt hoỏ và thay đổi cấu trỳc rồi được vận chuyển tới tiểu đơn vịα, làm cho ỏi lực của tiểu đơn vị αđối với GDP giảm xuống, GDP rời khỏi vị trớ hoạt động. Nhờđú mà GTP mới gắn vào được tiểu đơn vịα. Sự liờn kết của GTP đối với tiểu đơn vị α là rất cao vỡ trong tế bào, nồng độ GTP cao hơn GDP và ỏi lực của tiểu đơn vịα đối với GTP cũng cao hơn rất nhiều so với GDP. Sau khi GTP đó liờn kết vào tiểu đơn vịα, nú sẽ tỏch khỏi cỏc tiểu đơn vị βγ và thụ thể. Lỳc này protein G là cỏc dimer cú hoạt động chức năng vỡ cỏc tiểu đơn vịβ và γ sẽ khụng bao giờ tỏch rời khỏi protein G ở dạng bất hoạt trừ khi chỳng bị biến tớnh. Khi cỏc tiểu đơn vịα, β, γ tỏch rời nhau ra thỡ chỳng sẽ tương tỏc với cỏc cơ quan cảm ứng (Clapham và Neer, 1993).
Một khi GTP bị phõn cắt thành GDP do chớnh hoạt động của tiểu đơn vịα thỡ cỏc tiểu đơn vịα, β, γ sẽ liờn kết trở lại, trở về trạng thỏi bất hoạt và quay trở về thụ thể. Sự tỏi hợp này sẽ khoỏ lại cỏc tiểu đơn vị. Vỡ vậy, mặc dự tiểu đơn vị βγ khụng liờn kết với GTP nhưng sự hoạt hoỏ của nú lại phụ thuộc vào sự hoạt hoỏ của tiểu đơn vịα.
Hoạt tớnh GTPase của tiểu đơn vị α được tăng cường nhờ hai enzym cảm ứng, là phospholipase C (Bertein et al., 1992) và cGMP phosphodiesterase (Arshavzky và Bownds, 1992). Trước đõy chỳng ta vẫn nghĩ rằng chỉ cú cỏc chất phõn tử lượng thấp, cỏc protein liờn kết với GTP dạng monomer như ras là được điều hoà bởi cỏc protein hoạt hoỏ GTPase (GAPs) (Trahey và Mc Cormick, 1987; Gibbs et al., 1988). Việc tỡm ra một yếu tố cảm ứng cú thểđiều chỉnh hoạt tớnh GTPase của tiểu đơn vịα cú ý nghĩa rằng với mỗi một
Thụ thể gắn với ligand hoạt hóa
Hỡnh 6.5
yếu tố cảm ứng cú thểảnh hưởng tới thời gian hoạt hoỏ của chớnh nú. Về mặt nguyờn lý thỡ cỏc yếu tố cảm ứng khỏc nhau cú thể làm như thế với cỏc mức độ khỏc nhau.
Trước đõy cỏc nhà khoa học vẫn cho rằng chỉ cú tiểu đơn vị α mới làm nhiệm vụ điều hoà cỏc yếu tố cảm ứng, trong khi vai trũ của βγ chỉ là để bất hoạt tiểu đơn vịα, kiềm chế tớn hiệu và ngăn cản sự nhiễu khi khụng cú sự kớch thớch hormon (Birnbaumer, 1987; Birnbaumer et al., 1990; Gilman, 1987). Nhưng thực tế thỡ cỏc tiểu đơn vị βγ cũng cú thể điều hoà cỏc cơ quan cảm ứng (kờnh muscarinic K+ ở tim) (Logothesis et al., 1987). Như vậy, cỏc yếu tố cơ quan cảm ứng khụng chỉđược điều hoà bằng cỏc tiểu đơn vịα, hoặc chỉ riờng βγ, mà cả hai yếu tốđều tham gia điều hoà theo cỏc con đường phức tạp khỏc nhau. Khi một cơ quan cảm ứng được điều hoà bởi cả hai tiểu đơn vị thỡ hoạt động của βγ cú thể phụ thuộc vào sự hoạt hoỏ của α, hoặc cũng cú thể quỏ trỡnh điều hoà của cỏc tiểu đơn vị là hoàn toàn độc lập. Bản g 6.2 Cỏc cơ qua n cảm ứng đượ c điều hoà bởi cỏc tiểu đơn vị của prot einG Tiểu đơn vị α Tiểu đơn vị βγ Kờnh K+ (IKach) Kờnh K+ Kờnh K+ (IKATP) - Adenylate cyclase i Adenylate cyclase i Adenylate cyclase II (IV) Adenylate cyclase II (IV) Aden ylate cycla se III - Phos pholi pase Cβ 1 Phos pholi pase Cβ 1b Phospholipase Cβ 2 Phospholipase Cβ 2
Phospholipase Cβ 3b Phospholipase Cβ 3 - Thụ thể kinas e (β- adren ergic, musc arinic ) CGMP phosphodiesterase - - Phos pholi pase A2 Kờnh Ca++ Kờnh Ca++ (?)
- Pheromon nấm men phản ứng trao đổi Tiểu đơn vị α Tiểu đơn vị βγ Kờnh K+ (IKach) Kờnh K+ Kờn h K+ (I ) KAT P - Ade nyla te cycl ase i Ade nyla te cycl ase i
Adenylate cyclase II (IV) Adenylate cyclase II (IV)