- O CH2 COOH phđn ly
2.3.Hoạt độ enzyme
2.3.1. Phương phâp xâc định hoạt độ enzyme
Khâc với trong hóa học phđn tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một câch trực tiếp mă thường xâc định giân tiếp thông qua xâc định độ hoạt động (còn gọi lă hoạt độ) của enzyme. Trong phân ứng có enzyme xúc tâc, sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng câch lăm thay đổi câc tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xâc mức độ hoạt động của enzyme thông qua xâc định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thănh trong phản ứng.
Để xâc định hoạt độ của enzyme ở câc dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng câc phương phâp vật lý hoặc hóa học. Câc phương phâp, so mău, đo khí, đo độ phđn cực, đo độ nhớt, chuẩn độ... được dùng phổ biến trong nghiín cứu định lượng câc phản ứng enzyme.
Có thể chia ra ba nhóm phương phâp sau:
1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thănh trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xâc định.
2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiín nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.
3. Chọn nồng độ enzyme như thế năo để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiín nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
2.3.2. Đơn vị hoạt độ enzyme
Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đê đưa ra khâi niệm đơn vị enzyme quốc tế (hoặc đơn vị enzyme tiíu chuẩn) văo năm 1961.
Đơn vị hoạt độ enzyme (U) lă lượng enzyme có khả năng xúc tâc lăm chuyển hóa 1 micromole (1µmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiíu chuẩn.
1 U = 1µmol cơ chất (10-6 mol)/ phút.
Từ năm 1972 người ta lại đưa thím khâi niệm Katal (Kat)
- Katal (Kat) lă lượng enzyme có khả năng xúc tâc lăm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giđy ở điều kiện tiíu chuẩn
1 Kat = 6.107 U Vă 1 U
60 1
= microkatal
Đối với chế phẩm enzyme, ngoăi việc xâc định mức độ hoạt động còn cần phải đânh giâ độ sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme lă hoạt độ riíng.
- Hoạt độ riíng của một chế phẩm enzyme lă số đơn vị enzyme/ 1mg protein (U/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme. Thông thường hăm lượng protein được xâc định bằng phương phâp Lowry. Khi đê biết khối lượng phđn tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phđn tử.
- Hoạt độ phđn tử lă số phđn tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phđn tử enzyme trong một đơn vị thời gian.
Hoạt độ phđn tử lớn (còn gọi lă con số chuyển hóa hoặc con số vòng: turnover number) có nghĩa lă phản ứng được xúc tâc xảy ra rất nhanh. Như vậy, hoạt độ phđn tử chính lă khả năng xúc tâc: hoạt độ phđn tử căng cao thì khả năng xúc tâc căng lớn. Ví dụ người ta đê xâc định được hoạt độ phđn tử cao của một số enzyme tinh khiết như catalase (5,6 x 106) acetyl - cholinesterase (3,0 x 106), β-amylase (1,2 x 106).
Cũng cần chú ý rằng trong một số trường hợp định nghĩa về đơn vị hoạt độ enzyme ở trín không thể âp dụng được. Nếu cần thiết chúng ta sẽ đưa ra câc điều kiện thí nghiệm tương đối hoặc định nghĩa của câc đơn vị khâc. Ở nơi có nhiều hơn một mối liín kết của phđn tử cơ chất bị tấn công thì một đơn vị hoạt độ enzyme lă lượng enzyme có khả năng xúc tâc lăm chuyển hóa một micro - đương lượng của nhóm liín quan sau 1 phút ở điều kiện xâc định. Ở nơi có hai phđn tử giống nhau phản ứng với nhau thì 1 đơn vị hoạt độ lă lượng enzyme xúc tâc cho sự chuyển hóa của 2 µmol cơ chất sau 1 phút.