2 Sản xuất oligosaccharides và và cacbohydrat monomeric từ cây oliu.
3.5Phương pháp đơn bào
Do sự phức tạp và năng suất thấp của phương pháp vi sinh kết hợp , phương pháp đơn bào đã được phát triển bởi việc sử dụng hệ thống tái tổ hợp E. coli . Ishikawa và Koizumi (2010) sản xuất bằng cách sử dụng các tế bào NeuAc E. coli tái tổ hợp bởi biểu hiện của GlcNAc 2 epimerase mã hóa bởi slr1975 từ Synechocystissp và NeuAc synthetase mã hóa bởi neuB . Trong hệ thống này , một dòng đột biến acetateresistant được sử dụng để nuôi cấy tế bào mật độ cao và gen aldolase NeuAc ( Nana ) đã bị đảo đoạn để ngăn chặn NeuAc bị tiêu hóa. Tái tổ hợp E. coli sản xuất 172 mM ( 53 g / L ) sau 22 giờ phản ứng với 540 mM ( 120 g / L) GlcNAc trong bình lên men 5L.Như hình.2 , oligosaccharides sialylated sialyllactose hoặc loại phức tạp hơn có thể được sản xuất trong các tế bào sống E. coli hoặc với tổng hợp từ NeuAc glucose qua con đường tổng hợp de novo ( Fierfort và Samain , 2008) hoặc với sự hấp thu của chúng trong môi trường bằng phương thức tận thu (Dékany et al. ,2010) . Trong hệ thống này , lactose được hấp thụ vào bên trong bởi LacY permease và sialylated bởi glycosyltransferaza , sử dụng CMP- Neu5Ac , đó là do liên tục tái sinh enzyme của tế bào sống ( Priem et al. , 2002). Đối với phương pháp tổng hợp tận dụng, Neu5Ac được vận chuyển vào tế bào bằng cách Nant permease và nó đã được bảo vệ khỏi sự suy thoái vì aldolase ( Nana ) ngừng hoạt động . theo con đường de novo tổng hợp sialyllactose, phương pháp tổng hợp CMP- Neu5Ac đã được đưa vào E. coli dẫn xuất dòng K12 ,từ E. coli biến đổi có thể sản xuất CMP- Neu5Ac trong tự nhiên là một chủng gây bệnh K1do đó không thích hợp để sử dụng công nghệ sinh học . Để thực hiện điều này , các α -2 ,3- gen sialyltransferase từ Neisseria meningitidis được coexpressed với các gen neuC , neuB và Neua Campylobacter jejuni mã hóa N- Acetylglucosamine -6-phosphate - epimerase , sialic axit synthase và
CMP- Neu5Ac synthetase , tương ứng . Đồng thời , Neu5Ac aldolase , ManNAc kinase , và β -galactosidase hoạt động đã bị loại bỏ để đảm bảo năng suất cao hơn của sialyllactose. Nồng độ Sialyllactose 25 g / L thu được với việc cung cấp cơ chất lactose liên tục trong nuôi cấy mật độ tế bào cao E. coli tái tổ hợp di động ( Fierfort và Samain , 2008). hệ thống này được tiếp tục mở rộng cho việc sản xuất của gangliosides GD3 ( Dékany et al. , 2010), và GM2 GM1 ( Antoine et al. , 2003) bằng cách bổ sung các gen biểu hiện glycosyltransferaza thích hợp.