Phương pháp nuôi cấy , phân lập và định danh vi khuẩn .
Môi trường tổng hợp : NA + 2% NACl
Môi trường đặc trưng : TCBS
Môi trường dùng cho các phản ứng sinh hóa : Saccharose, Glucose, Lactose, Manitol, Maltose, KIA, MR, VP .
Các hóa chất để nhuộm Gram : Crystal violet, Fushine, dung dịch Lugol, cồn 960 .
Nuôi vi khuẩn: Hầu hết ở các môi trường, vi khuẩn được nuôi ở 20-22ºC từ 24 - 48 giờ .
Nuôi cấy, phân lập Thu mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh cá Thử phản ứng sinh hóa Nhuộm Gram Hình thái khuẩn lạc
Kết luận giống và loài vi khuẩn gây bệnh
Nuôi cấy phân lập :
Ta tiến hành đốt nóng đỏ que cấy sau mỗi vùng cấy để làm cho mật độ vi khuẩn giảm dần, mỗi tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc sau thời gian nuôi cấy, có thể cấy từ 3 – 4 vùng trên 1 đĩa thạch.
Nuôi cấy phân lập bằng cách cấy trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm (gan , thận, vết loét). Dùng que cấy hơ nóng dưới ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy bệnh phẩm cấy trên đĩa thạch chứa môi trường NA và TCBS, đặt trong ở 20 – 220C trong thời gian từ 24 – 48h.
Nuôi cấy thuần chủng
Sau 24 giờ, chọn các khuẩn lạc có màu sắc đặc trưng, chiếm ưu thế đem cấy chuyền lần 1 trên môi trường NA + 2% NACl và tiếp tục quan sát màu sắc, hình dạng khuẩn lạc sau 24 – 48 giờ. Quá trình cấy chuyền cho đến lần thứ 3.
Thử phản ứng sinh hóa và nhuộm Gram
Các bước nhuộm Gram thực hiện theo phương pháp của Chritian Gram (1884) để xác định các loại vi khuẩn.
− Nhỏ dung dịch Violet (màu tím) lên mẫu để khô 30-60 giây.
− Rửa nhanh bằng nước và vẩy khô.
− Nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản và để trong 1 phút.
− Rửa nhanh và vẩy khô nước.
− Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 90% lên để tẩy màu.
− Rửa nhanh và vẩy khô nước.
− Nhỏ dung dịch Fushin lên mẫu,để 1-2 phút.
Sơ đồ 3.3. Quy trình nhuộm Gram
Các phản ứng sinh hóa :
Hình 3.1. Phản ứng test sinh hóa
Lấy dòng thuần từ môi trường để thực hiện các phản ứng của test sinh hóa:
−Thử trên môi trường KIA
- Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy vi khuẩn nghiên cứu ria 1 đường thẳng ở phần thạch nghiêng.
- Sau đó cắm thẳng que cấy xuống phần thạch đứng (không chạm đáy) - Nuôi cấy ở nhiệt độ 30-370C, đọc kết quả sau 24h.
- Đọc khả năng lên đường Glucose: nếu (+), phần thạch đứng chuyển màu vàng. Nếu (-), phần thạch đứng chuyển vẫn giữ màu môi trường
- Đọc khả năng lên men đường Lactose: nếu (+), phần thạch chuyển sang màu vàng. Nếu (-), phần thạch không đổi màu
- Nếu có khả năng lên men cả 2 loại đường: toàn bộ ống nghiệm chuyển sang màu vàng
- Nếu không có khả năng lên men toàn bộ ống nghiệm giữ nguyên màu ban đầu.
- Đọc khả năng sinh hơi: (+) khi thạch bị nứt hay bị đẩy lên trên. Âm tính (-) khi không có hiện tượng nứt thạch.
- Đọc khả năng sinh H2S: (+) khi môi trường có màu đen. (-) khi môi trường không có màu đen.
−Thử khả năng sinh Indol
- Dùng môi trường Tryptone cho phản ứng này.
- Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu cấy vào môi trường Tryptone lỏng.
- Nuôi cấy ở nhiệt độ 30-370C, trong 24 giờ. Dùng thuốc thử Kovac nhỏ 0,2 – 0,3 ml vào ống nghiệm đã nuôi cấy vi khuẩn và lắc đều sau đó đọc kết quả.
Dương tính (+): có một vòng đỏ sẫm nổi lên trên bề mặt môi trường.
Âm tính (-): có một vòng màu vàng sẫm nổi lên trên môi trường, đó là màu của thuốc thử Kovac.
−Thử khả năng di động:
- Dùng môi trường manitol di động.
- Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy 1 đường thẳng đứng chính giữa ống nghiệm.
- Nuôi ở nhiệt độ 30-370C.
Khả năng lên đường Manitol: (+) môi trường màu vàng, (-) giữ nguyên môi trường ban đầu.
Khả năng di động: (+) vi khuẩn mọc thành một đường thẳng, (-) vi khuẩn mọc ra xung quanh bên cạnh.
− Thử phản ứng Nitrate:
- Cấy vi khuẩn cần nghiên cứu vào ống nghiệm chứa môi trường Nitrate.
- Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24 -48 giờ.
- Nhỏ thuốc thử: 1 ml Acid Sulfalinic và 1 ml Naphthyllaminue. Đọc kết quả: (+) xuất hiện màu đỏ 1-2 phút.
(-) không xuất hiện màu đỏ
− Thử phản ứng Citrate:
- Dùng môi trường Simoms Citrate Agar đựng trong các ống nghiệm. cấy vi khuẩn nghiên cứu vào môi trường trên.
Đọc kết quả: (+) sẽ xuất hiện màu xanh da trời. (-) vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây của môi trường.
− Thử phản ứng methyl Red:
- Dùng ống nghiệm chứa môi trường lỏng MR-VP để thử phản ứng này - Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu cấy vào môi trường trên.
- Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24 -48 giờ.
- Nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl Red, lắc đều và đọc kết quả: (+) xuất hiện màu đỏ, nếu (-) xuất hiện màu vàng.cả dương tính và âm tính thì xuất hiện cả màu đỏ và vàng.
− Thử phản ứng V – P (Voges – Proskaner test):
- Dùng một ống nghiệm chứa môi trường MR – VP lỏng - Cấy vi khuẩn lên môi trường trên
- Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24 -48 giờ.
- Nhỏ vào ống nghiệm môi trường đã cấy vi khuẩn: 1ml Alpha – Naphthol 10% và 1 ml KOH 20%. Lắc nhẹ ít phút rồi đọc kết quả.
(+) : xuất hiện màu đỏ cam ở bờ mặt môi trường trong ống nghiệm (-) : xuất hiện màu xanh đồng
− Kiểm tra khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn:
- Dùng các môi trường có chưa các loại đường khác như: Mantose, sucrose, glucose…….
- Cấy vi khuẩn cần nghiên cứu vào môi trường đường nói trên - Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24 giờ.
Đọc kết quả: (+) môi trường chuyển từ màu hồng sang màu vàng (-) môi trường không thay đổi màu sắc.
Phương pháp thử kháng sinh đồ
1ml dung dịch huyền phù vi khuẩn đã xác định với mật độ 108CFU/ml được dàn đều trên bề mặt môi trường NA2%NaCl (Nutrien Agar), dùng kim tiêm hút phần dung dịch còn dư sau đó dùng kẹp nhọn vô trùng đặt các đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt môi trường. Với mỗi đĩa thạch thí nghiệm đặt 3 đĩa giấy ở các vị trí khác nhau. Lật ngược đĩa và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra đường kính vòng vô khuẩn sau 24h, 48h và 72h nuôi cấy. Các kháng sinh sử dụng đã được mua tại các quầy thuốc thú y và thuốc tân dược trên địa bàn thành phố Huế.
Hình 3.2.Kháng sinh Oxy-tetracyline 3.4.3.3. Nghiên cứu bệnh nấm
Môi trường Potato Yeast Glucose Agar (PYGA), có bổ sung kháng sinh Streptomycine,Peniciline.
Sơ đồ 3.4. Nghiên cứu bệnh nấm
Phương pháp nuôi cấy và phân loại nấm
Mẫu bệnh nghi bị nhiễm nấm
Nuôi cấy trên môi trường PYGA
Nuôi cấy thuần chủng