Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3.2. Tỏch chiết DNA và phõn tớch di truyền chỉ thị phõn tử
3.3.2.1. Kỹ thuật tỏch chiết và tinh sạch DNA.
Tỏch chiết DNA tổng số từ mẫu lỏ theo phương phỏp CTAB cải tiến. DNA lỳa được tỏch chiết và tinh sạch theo phương phỏp CTAB cải tiến ( của phũng thớ nghiệm trường đại học Ghent, Vương quốc Bỉ).
A. Húa chất dựng trong tỏch chiết DNA
+ Dung dịch đệm chiết ( extraction buffer) gồm cú cỏc thành phần theo bảng sau:
Bảng 3.1: Thành phần dung dịch đệm EB (extraction buffer)
Thành phần Thể tớch (V= 100ml) dH2O (Nước cất khử ion) 63 ml Tris HCl 1M; pH= 8.0 10 ml EDTA 0.5M; pH= 8.0 10 ml NaCl 5M 10 ml β – Mercaptol ethanol 7 àl
+ Dung dịch CTAB Buffer và TE ( 10:0,1)
Bảng 3.2: Thành phần dung dịch CTAB buffer
Đệm CTAB Thể tớch (V=500ml) CTAB 10 g EDTA 0.5M; pH= 8.0 50 ml NaCl 5M 200 ml TrisHCl 1M;pH= 7.5 100 ml dH2O ( nước cất hai lần) 150 ml Bảng 3.3: Thành phần dung dịch TE (10:0,1) Đệm TE (10:0.1) Thể tớch (V= 100 ml) TrisHCl 1M; pH= 8.0 1000 àl EDTA 0.5M; pH= 8.0 20 àl dH2O 98.8 ml
+ Dung dịch SDS (Sodium dedoxyl sulfat) 10% + Ethanol 96%
+ Ethanol 70%
+ Isopropanol alcohol
+ Chloroform : Isomyl alcohol (24:1) + Rnase (10mg/ml)
B. Cỏc bước tỏch chiết DNA
- Phương phỏp CTAB cải tiến trờn cơ sở phương phỏp của Shagai – Maroof ( năm 1984). Phương phỏp này cho DNA cú chất lượng cao, rẻ tiền nhưng tốn nhiều thời gian hơn so với cỏc phương phỏp khỏc.
Quy trỡnh thực hiện gồm cỏc bước:
Bước 1: Lỏ của cỏc dũng, giống lỳa nghiờn cứu được cắt và lấy mẫu vào cỏc ống eppendorf 1,5ml để trong đỏ lạnh để giữ cho lỏ được tươi. Lỏ được lấy vào buổi sỏng sớm là lỳc nồng độ muối trong lỏ thấp, cỏc enzyme hoạt động ớt là điều kiện tốt để tỏch chiết DNA.
Bước 2: Nghiền mẫu cựng với nitơ lỏng trong eppendorf hoặc trong cối, đến khi thành dạng bột mịn, khi nghiền luụn để mẫu trong nitơ lỏng.
Bước 3: Cho mẫu đó nghiền mịn vào trong ống eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết EB (extraction buffer) rồi đảo đều, giữ trong đỏ và thờm 50àl SDS 10%.
Bước 4: Đặt vào thiết bị ủ trong 30 phỳt ở 65oC, thỉnh thoảng đảo cho dung dịch được trộn đều.
Bước 5: Ly tõm 13500 vũng/ phỳt trong 20 phỳt.
Bước 6: Lấy ra đổ dịch nổi ở phớa trờn sang 1 eppendorf mới thờm 1ml Isopropanol alcohol rồi để vào tủ 4oC cho kết tủa khoảng 30 phỳt ( hoặc qua đờm), khụng để vào tủ lạnh sõu – 20oC vỡ sẽ gõy hiện tượng kết tủa muối.
Bước 7: Ly tõm 13500 vũng/ phỳt trong 25 phỳt.
eppendorf. Cho 400 àl đệm TE ( 10:0.1) cho vào tủ ấm 65oC ủ trong 5 phỳt. Dựng pipet nhỏ hoặc bỳng nhẹ hũa tan tủa, cú thể giữ ở 4oC qua đờm.
Bước 9: Cho 3 àl Rnase ( 10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC trong 3 tiếng.
Bước 10: Thờm 400 àl đệm CTAB, đặt vào nhiệt độ 65oC trong 15 phỳt thỉnh thoảng trộn, lắc đều.
Bước 11: Cho vào tủ hỳt thờm 800 àl Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) lắc trộn từ 5 – 7 phỳt nhằm loại bỏ protein.
Bước 12: Ly tõm 13500 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Dung dịch bờn trong eppendorf tỏch thành hai phần.
Bước 13: Sử dụng pipet hỳt chuyển phần dịch nổi ở phớa trờn sang 1 eppendorf mới. Nếu chưa sạch cú thể chiết lại lần hai bằng Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1)
Bước 14: Thờm 2.5 lần thể tớch Ethanol 96% và cất giữ trong tủ lạnh sõu (-20oC).
Bước 15: Ly tõm 13500 vũng/phỳt trong 30 phỳt. Loại bỏ cồn để giữ lại phần tủa trắng ở đỏy ống.
Bước 16: Rửa tiếp bằng 400 cồn 70% rồi đưa vào mỏy ly tõm 13500 vũng/phỳt trong 5 phỳt.
Bước 17: Đổ cồn đi giữ lại tủa, cho vào mỏy làm khụ chõn khụng khoảng 10 phỳt làm khụ kết tủa (DNA), sau đú cho 100àl TE (10:0,1) vào mỗi eppendorf hũa tan kết tủa.
Bước 18: Giữ DNA trong tủ lạnh sõu ( -20oC) để sử dụng cho cỏc bước nghiờn cứu tiếp theo.
3.3.2.2. Nhõn DNA bằng kỹ thuật PCR với cỏc mồi SSR.
Cỏc chu trỡnh của phản ứng PCR với cỏc mồi SSR
+ Bước biến tớnh: Ở chu kỳ đầu tiờn biến tớnh mẫu DNA ở nhiệt độ 94oC trong 5 phỳt 30 giõy.
+ Bước gắn mồi: thực hiện ở nhiệt độ 55oC trong 30 giõy. + Bước tổng hợp ở nhiệt độ 72oC trong 30 giõy.
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng PCR cho một mẫu Thành phần Thể tớch ( àl) DNA 5 10x buffer 2 dNTPs 1 Mồi (primer) 1 Taq polymerase 0,06 Nước cất 2 lần 11,64 Tổng thể tớch 20
Hỡnh 3.1: Sơ đồ chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR.
Thực hiện cỏc bước trờn với 35 chu kỳ sau đú ở chu kỳ cuối cựng chạy thờm bước 72oC trong 7 phỳt sau đú bảo quản ở 4oC.
Sau khi chạy PCR xong cất giữ mẫu ở 4oC. Trước khi đem phõn tớch cần phải nhỏ thuốc nhuộm (loading dye) vào cỏc mẫu, sau đú đưa vào mỏy PCR gõy biến tớnh ở 94oC trong 5 phỳt sau đú bỏ ra để ngay vào đỏ lạnh rồi tiến. hành tra mẫu DNA vào bản gel điện di.
3.3.2.3. Phõn tớch kết quả PCR bằng kỹ thuật điện di trờn gel polyacrylamide
A. Chuẩn bị bản gel:
Lau 2 tấm kớnh 1 tấm lớn và 1 tấm nhỏ. Lau 2 lần bằng nước cất khử trựng và 2 lần bằng cồn 70%. Sau đú, lau kớnh lớn với 300 àl dung dịch Glass coat, kớnh nhỏ lau với 300 àl dung dịch Glass bind. Để sau 5 phỳt, lau lại kớnh lớn bằng giấy sạch, riờng với kớnh nhỏ lau lại bằng cồn 70% và ghộp 2 kớnh lại.
Pha gel acrylamide: Cỏc húa chất dựng để pha acrylamide phải giữ trong tủ lạnh 4oC. Sau khi lau kớnh xong, lấy cỏc húa chất ra pha:
Bảng 3.5: Thành phần gel polyacrylamide cho một bản gel.
Thành phần Thể tớch (àl)
Polyacrylamide 4% 20 ml
TEMMED 19 ml
APS 190 ml
Cho cỏc húa chất vào cốc, lắc đều, sau đú đổ nhanh tay vào tấm kớnh đó ghộp, cài tấm lược để tạo lỗ giếng, lấy thăng bằng cho bản gel. Sau đú chờ 1 – 2 tiếng để bản gel đụng lại.
Trước khi tra mẫu PCR vào bản gel cần phải đưa tấm kớnh vào mỏy điện di chạy trước 10 – 20 phỳt để bản gel núng lờn sau đú mới được tra mẫu vào giếng.
B. Kỹ thuật nhuộm bạc bản gel polyacrylamide Chuẩn bị cỏc dung dịch nhuộm:
dung dịch Glacial acetic acid và 900ml nước cất.
*) Dung dịch hỗ trợ (Enhancing solution): pha 1,5 ml Enhancing 100% vào 1 lớt nước khuấy đều.
*) Dung dịch nhuộm (Staining solution) gồm: 1g bạc nitrat ( AgNO3) vào 1l nước cất, sau đú trước khi nhuộm bổ sung thờm 1,5 ml formaldehyd 37%.
*) Dung dịch hiện (Developing solution): hũa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1l nước cất và để lạnh ở 4oC. Trước khi sử dụng cho thờm 1,5 ml formaldehyd 37% và 200àl natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).
Tiến hành nhuộm
*) Sau khi chạy điện di xong, thỏo lấy tấm kớnh nhỏ cú bỏm bản gel để tiến hành nhuộm.
*) Cố định gel: đặt tấm kớnh vào khay sao cho mặt cú bỏm gel hướng lờn trờn, đổ dung dịch cố định, dừng phản ứng ( Fix, Stop solution) vào để khoảng 20 – 30 phỳt.
*) Tăng khả năng bắt màu: Chuyển tấm kớnh từ dung dịch cố định sang dung dịch hỗ trợ, để khoảng 20 – 25 phỳt.
*) Rửa tấm kớnh: cho tấm kớnh vào nước cất trong 2 – 3 phỳt, rửa như vậy 2 lần.
*) Nhuộm bản gel: Sau khi rửa sạch tấm kớnh chuyển sang dung dịch nhuộm ( Staining solution), nhuộm trong khoảng 25 – 30 phỳt. Sau đú bỏ ra trỏng qua nước cất khoảng 10 giõy.
*) Hiện bản gel: cho bản gel vào dung dịch hiện (Developing solution) đó được để lạnh ở 4oC. Chỳ ý quan sỏt đến khi nào cỏc băng DNA xuất hiện thỡ kết thỳc phản ứng.
*) Cố định bản gel: Chuyển tấm kớnh sang dung dịch cố định/dừng phản ứng trong 5 – 10 phỳt.
*) Rửa lại tấm kớnh bằng nước cất 3 – 5 phỳt, để gel khụ tự nhiờn sau đú ghi nhận kết quả.
Chỳ ý: Tất cả cỏc bước đều được thực hiện trờn mỏy lắc với tốc độ 75 – 90 vũng/phỳt.
- Phõn tớch chỉ thị phõn tử SSR của quần thể F2 theo phương phỏp của Panaud và cộng sự (năm 1996).
- Phương phỏp chọn lọc chỉ thị phõn tử liờn kết với gen phục hồi IR58025A x R100 (P1) ↓ (P2) Phenotyping, genotyping ← F2 ← F1 x P2 ↓ BC1F1 ↓ BC1F2 Genotyping, phenotyping ↓ BC1F3 Phenotyping
(Khẳng định lại liờn kết markers phõn tử với gen phục hồi) Hỡnh 3.2: Sơ đồ chọn chỉ thị phõn tử cho gen phục hồi