Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2Kết quả tỏch chiết và tinh sạch mẫu DNA thu nhận từ lỏ.
Ngày nay, với cỏc kỹ thuật hiện đại và sự phỏt triển của cỏc loại thiết bị mỏy múc trở thành một cụng cụ đắc lực giỳp cỏc nhà nghiờn cứu tỏch chiết DNA một cỏch nhanh chúng, dễ dàng, cỏc mẫu DNA nguyờn vẹn, chất lượng DNA tốt, nồng độ cao. Mặc dự ra đời từ khỏ lõu, tuy nhiờn phương phỏp tỏch chiết DNA bằng Chlorofrom – CTAB vẫn được sử dụng rộng rói và đến nay đó được cải tiến để trở nờn ưu việt hơn. Trong thớ nghiệm này, chỳng tụi sử dụng phương phỏp CTAB cú cải tiến để tỏch chiết mẫu DNA từ lỏ cỏc dũng bố mẹ cũng như cỏc cỏ thể trong quần thể thớ nghiệm.
Tỏch chiết, tinh sạch DNA là bước đầu tiờn trong quỏ trỡnh làm thớ nghiệm. Thao tỏc này đúng vai trũ tiờn quyết trong cả quỏ trỡnh thớ nghiệm, bởi nếu khụng cú được mẫu DNA tốt, cỏc bước tiếp theo của thớ nghiệm cú làm tốt đến đõu thỡ cũng khụng thể cho kết quả như ý muốn được.
Cỏc mẫu lỏ của dũng mẹ IR58025A và dũng bố R100 mang gen tương hợp rộng, quần thể F2 của tổ hợp lai IR58025A/R100 và 44 dũng phục hồi cú triển vọng ( Nguồn vật liệu do Trung tõm nghiờn cứu và phỏt
triển lỳa lai – Viện Cõy Lương Thực và Cõy Thực Phẩm cung cấp). Thu cỏc mẫu lỏ lỳa 3 tuần tuổi. Sau khi tỏch chiết DNA bằng phương phỏp CTAB cú cải tiến, cỏc mẫu DNA thu được sẽ được tinh sạch và kiểm tra bằng cỏch điện di trờn gel Agarose 0,8% cựng với DNA chuẩn nồng độ. Chỉ khi nào DNA cũn nguyờn vẹn và đủ độ tinh sạch thỡ cỏc thớ nghiệm tiếp theo mới thực hiện được.
Chỳ thớch: 8: DNA Chuẩn nồng độ 200ng/àl 1 – 17: Cỏc dũng của quần thể F2
Hỡnh 4.1: Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của DNA trờn gel Agarose. Hỡnh 4.1 cho thấy, số băng xuất hiện ớt chứng tỏ DNA cũn nguyờn vẹn, cỏc băng hiện lờn rừ ràng. Như vậy, mẫu DNA tỏch chiết đều đạt yờu cầu để thực hiện cỏc thớ nghiệm tiếp theo. Kết quả tỏch chiết DNA cho thấy DNA cú chất lượng tốt, nồng độ trong khoảng từ 200 – 300ng/àl khi so sỏnh với lambda DNA chuẩn nồng độ 200ng/àl giếng số 8. DNA khụng bị đứt góy, việc loại bỏ RNA bằng RNase tiến hành khỏ tốt thể hiện cỏc băng điện di gọn, sỏng rừ.
Sau khi tỏch chiết, tinh sạch DNA đảm bảo đủ độ tinh sạch, bước tiếp theo cần thiết là kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR cú chớnh xỏc hay khụng, nghĩa là đoạn DNA được nhõn lờn trong phản ứng PCR cú phải là đoạn quan tõm hay chỉ là một đoạn bắt cặp tương đồng nào đú. Sau khi cú DNA tổng số và xỏc định được nồng độ, tiến hành pha loóng lại để được nồng độ DNA từ 10 – 20 ng/àl. Làm phản ứng với cỏc mồi nghiờn cứu và kiểm tra trờn gel agarose 0,8% với đệm TBE 0,5x. Kết quả kiểm tra được minh họa ở hỡnh 4.2 và Hỡnh 4.3.
Kết quả cho thấy phản ứng PCR được tiến hành khỏ tốt, cỏc băng sỏng rừ và gọn tương đối đồng đều đỳng kớch thước khi so sỏnh với thang chuẩn (ladder), cú thể tiến hành phõn tớch trờn gel polyacrylamide với những đoạn DNA cú sự sai khỏc về kớch thước nhỏ. Sau khi cú kết quả điện di trờn gel
agarose phản ứng PCR cú kết quả tốt, tiến hành điện di trờn gel polyacrylamide 4,5%.
Chỳ thớch: 10: Thang chuẩn 1kb 1 – 17: Cỏc dũng quần thể F2
Hỡnh 4.2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi RM258
Chỳ thớch: 9: Thang chuẩn 1kb 1 – 17: Cỏc dũng quần thể F2
Hỡnh 4.3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi RM171
Sự đa hỡnh giữa hai giống lỳa cú thể được phỏt hiện bằng chiều dài khỏc nhau của cỏc đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cựng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hỡnh DNA giữa cỏc dũng cho gen và nhận gen với chỉ thị liờn kết chặt là điều kiện tiờn quyết để cú thể sử dụng MAS trong phỏt hiện sự cú mặt của gen phục hồi trong cỏc thế hệ lai sau này.