Trong phân tử Cloramphenicol có nhóm amin thơm và nguyên tử clo hữu cơ cho những phản ứng đặc trưng trong hai thí nghiệm sau.
Tiến hành:
Trong ống nghiệm đựng 0,1g Cloramphenicol, thêm 5 ml dung dịch acid Sulfuric 15%, thả hai viên kẽm hạt, để yên khoảng 1,5-2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho đến khi tan hết kẽm. Lọc lấy dịch lọc để tiến hành các phản ứng 1 và 2.
+ Phản ứng 1: Tạo phẩm màu nitơ (amin thơm I):
Cơ chế:
Nhóm –NO2 sau khi khử hóa bằng H (Zn/acid) chuyển thành amin thơm bậc I, cho phản ứng đặc trưng của nhóm này là tạo phẩm màu nitơ.
Ar NO2 +H (Zn/H+) Ar NH 2 + H2O Ar NH2 + HNO2 [Ar N+ N]Cl +2 naphtol NaOH Ar N N HO Tiến hành:
Lấy khoảng 1 ml dịch lọc vào một ống nghiệm, thêm 1-2 giọt dung dịch NaNO2 0,1M. Thêm 0,5 ml dung dịch β- naphtol trong kiềm, xuất hiện màu đỏ và tủa đỏ.
Chú ý: pha dung dịch 2- naphtol ngay trước khi dùng: lấy khoảng 0,5g β- naphtol hòa vào 4 ml natri hydroxyd 10%, thêm nước đủ 10 ml.
+ Phản ứng 2: xác định Cl- sinh ra từ nguyên tử clo hữu cơ có trong phân tử Cloramphenicol, do hydro mới sinh.
Cơ chế: O2N C OH C H CH2OH H NH-COCHCl2 H2N R + Cl- + 2H2O
AgNO3 + Cl AgCl + NO3-
Tiến hành:
Lấy 1 ml dịch lọc vào một ống nghiệm không trộn lẫn tạp Clorid, thêm 2 ml nước, 0,5 ml dung dịch AgNO3 5%, xuất hiện tủa vón màu trắng xám, tan trong ammoniac (tủa AgCl)
B.Cloramphenicol chuyển sang màu vàng→ đỏ khi đun nóng trong kiềm
Tiến hành: trộn 0,1 g Cloramphenicol vào 4 ml dung dịch NaOH 10% trong ống nghiệm.Đun nóng từ từ trên đèn cồn, xuất hiện màu vàng → vàng da cam →đỏ.
Thử tinh khiết:
pH dung dịch nước: trộn kỹ 0,1 g chất thử vào 20 ml nước mới đun sôi để nguội (không có khí CO2 hoặc NH3). Thêm 0,1 ml dung dịch chỉ thị Bromothymol xanh, màu phải chuyển khi thêm không quá 0,1 ml HCl 0,02 M hoặc 0,1 ml NaOH 0,02M.
Ghi chú: xanh Bromothymol chuyển màu : vàng (pH 6,0) đến xanh (pH 7,6)
Tiến hành: hòa tan 1,5 g chất thử vào ethanol tuyệt đối. Thêm ethanol tuyệt đối đến vừa đủ 25 ml (dùng bình định mức). Đo góc quay cực dung dịch thu được, xác định trị số [α]D20 theo công thức: [α]D20= 1 00 α l c
α là góc quay cực đo được l: độ dài của ống đo (dm) c: nồng độ dung dịch đo (%)
chú ý: chuẩn bị dung dịch đo từ chất thử đã sấy khô
Clorid (Cl-): không được quá 0,01%
Tiến hành: cân 1,00g chế phẩm, thêm 20 ml nước và 10 ml acid nitric (10%), lắc 5 phút. Lọc qua giấy lọc đã được rửa bằng nước cất nhiều lần, mỗi lần với 5 ml dung dịch nước đến khi 5 ml nước rửa không bị đục khi cho thêm 0,1 ml dung dịch acid nitric đậm đặc (70%) và 0,1 ml dung dịch bạc nitrat 4,25%. Lấy 15 ml dịch lọc và tiến hành thử theo phụ lục I.
Các chất liên quan:
Pha tĩnh: Silicagel GF 254.
Pha động: hỗn hợp dung môi: nước- methanol- chloroform (1:10:90) -Chuẩn bị các dung dịch sắc ký:
+Dung dịch thử: 0,1 g chất thử trongn10 ml aceton.
+ Dung dịch đối chiếu (a): 0,1g Cloramphenicol chuẩn trong 10 ml aceton. +Dung dịch đối chiếu (b): pha loãng 0,5 ml dung dịch đối chiếu (a) thành 100 ml bằng aceton.
-Chấm lên bản sắc ký các lớp riêng biệt: (1): 1 µl dung dịch thử
(2): 20 µl dung dịch thử
(3): 1 µl dung dịch đối chiếu (a) (4): 20 µl dung dịch đối chiếu (b)
Triển khai sắc khí cho đến khi dung môi chạy được khoảng 15 cm. Lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí. Kiểm tra bản mỏng bằng đèn tử ngoại 254 nm.
Nhận định kết quả:
+ Với mục đích thử tinh khiết: bất kỳ vết phụ nào trên sắc đồ dung dịch (2) không đậm hơn vết trên sắc đồ dung dịch (4) (0,5%)
+ Với mục đích định tính: vết chính trên sắc đồ dung dịch (1) phải tương tự về vị trí và kích thước với vết chính trên sắc đồ dung dịch (3)
Khối lượng sau khi sấy khô ở 100-1050, phải ≤ 0,5% (dùng 1,0g chất thử).
Định lượng: bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại
Nguyên tắc: Do Cloramphenicol trong công thức phân tử có nhân thơm nên có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại, người ta đã áp dụng tính chất này để xây dựng phương pháp định lượng chúng.
Tiến hành: Hòa tan khoảng 90- 100 mg Cloramphenicol (cân chính xác) vào khoảng 200 ml nước, có thể nâng nhiệt độ lên 45- 500 C cho dễ tan, trong cốc dung tích 250 ml. Chuyển dung dịch vào bình định mức dung tích 500 ml. Tráng cốc 3 lần, mỗi lần 50 ml nước ấm. Tập trung dịch tráng vào bình định mức. Cuối dùng thêm nước đến vạch, trộn kỹ (dung dịch 1). Lấy 10 ml dung dịch 1 cho vào bình định mức dung tích 100 ml, thêm nước đến vạch trộn đều (dung dịch 2).
Đo độ hấp thụ D của dung dịch 2 trên máy quang phổ ở bước sóng 278 nm, cốc đo 1 cm. Tính hàm lượng Cloramphenicol với trị số A(1%,1) ở 278 nm bằng 297