Thời gian nghiên cứu

-. Thời gian bắt đầu: 29/06/2021 - Thời gian kết thúc: 15/08/2021

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp chỉ thị hình thái

Đặc điểm hình thái

Quan sát và mô tả hình thái bên ngoài và vi phẫu cây Thiên Thảo. Dựa vào các phương pháp nghiên cứu thực vật của PGS.TS Trương Thị Đẹp (2010) có cải tiến, các bộ phận mô tả bao gồm: thân, lá, rễ, hoa, quả , hạt. Mỗi đặc điểm thực hiện 10 mẫu

- Thân: Đo hết phần thân trên trên mặt đất, từ mặt đất đến cuối chồi ngọn..

- Lá: Đo hai chỉ số: Chiều dài lá từ cuống lá đến chót lá; chiều rộng phần phiến lá lớn nhất..

- Rễ: Đo từ phần dưới mặt đất (miền trưởng thành) đến chóp rễ.

- Hoa: Đếm số tràng hoa, nhị và nhụy. Mô tả màu săc và hình dạng tràng hoa. - Quả: Đo kích thước quả, mô tả màu săc và hình dạng quả.

- Hạt: Mô tả màu săc và hình dạng hạt, số lượng hạt trong một quả.

Cách đo: Đặt thước có chia đơn vị đo cm và mm. Đặt thước song song với mẫu và vuông góc với mặt đất hoặc vuông góc giữa hai thước. Sau khi đo đủ mỗi chỉ số 10 mẫu ta lấy kích thước trung bình.

2.2.2. Phương pháp chỉ thị phân tử

2.2.2.1. Tách chiết tổng số và tinh sạch DNA

Thu thập mẫu

- Thu thập mẫu lá tươi, tốt nhất khi lá còn non. - Đông khô mẫu lá tươi dùng lâu dài.

Tách chiết DNA

Sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo CTAB cải tiến (protocol của Phòng Thí nghiệm Di truyền học Trường Đại học Tổng hợp Ghent, Vương Quốc Bỉ).

1. Thu 2-5 gam lá, Tốt nhất là lá non, lá non sẽ cho ta lượng DNA nhiều nhất. Lá không bị nấm, vi khuẩn, virus. Dùng tươi hoặc đông khô.

2. Cắt lá thành từng đoạn 3mm – 5mm vào ống eppendoft 2ml, lượng lá khoảng 2/3 ống. Mỗi ống cho vào 1 viên bi sắt chuyên dụng, đậy nắp lại.

3. Cho eppendoft chứa lá vào nitơ lỏng ( sau khi đã ngâm dụng cụ đựng eppendoft vào nitơ lỏng), khi đủ độ lạnh lấy dụng cụ và eppendoft chứa mẫu ra. Lắp vào máy nghiền 2 phút, nếu chưa mịn ta cho thêm 1 chu kỳ 2 phút nữa.

4. Cho thêm vào mỗi eppendoft 1ml Extraction buffer (EB) đã được đun cách thủy 650C trước đó 20 phút, trộn đều, cắm trong nước đá. Thêm vào mỗi eppendoft 50 µl S.D.S 10% (lượng S.D.S cho vào theo tỉ lệ 50µl/ml W/v). Ủ trong máy lắc nước thời gian 30 phút ở nhiệt độ 650C.

Chú ý: trước khi cho dịch EB vào eppendoft ta cho thêm β- Mecaptoethanol 0,2% theo tỷ lệ 7µl BME/10ml EB, trộn đều. Trong quá trình ủ ở 650C, cứ 5 phút ta lại

đảo bằng tay một lần.

5. Ly tâm bằng máy ly tâm lạnh 40C, tốc độ 13.500 vòng/phút trong 20 phút. 6. Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang 1 ống eppendoft 2ml khác mới (ghi lại số

của mẫu). Thêm 1ml isopropanol (đã giữ ở tủ lạnh – 200C), đảo bằng tay một cách nhẹ nhàng trong 5 phút. Rồi để vào tủ lạnh 40C trong 30 phút hoặc qua đêm.

8. Đổ hết dịch nổi phía trên chỉ giữ lại tủa ở dưới đáy eppendoft để khô tự nhiên, thêm vào 400µl TE 8.0 (10:0.1). Cho vào ủ ở 650C trong 5 phút. Lấy ra búng cho tan tủa hoặc dùng pipetteman 200 hoặc 20 để hòa tan tủa (có thể để tan tự nhiên qua đêm ở nhiệt độ 40C) 9. Cho 3µl RNase (10mg/1ml) vào mỗi ống, trộn đều eppendoft bằng tay. Ly tâm cho lắng xuống khi tốc độ đạt 2000 vòng thì dừng lại. Ủ ở 370C trong 6 giờ, sau đó cho vào giữ ở 40C (có thể ủ qua đêm) cho tới khi làm tiếp bước 10.

10. Thêm vào mỗi eppendoft 400µl đệm CTAB và ủ trong bình cách thủy 650C, trong 15 phút. Thỉnh thoảng đảo trộn đều bằng tay.

11. Cho vào tủ hood, cho thêm 800µl Choloroform: isomylalcohol (24:1) vào mỗi eppendoft, lắc trộn bằng tay từ 5-7 phút.

12. Ly tâm ở 13.500 vòng/phút trong 10 phút.

13. Dùng pipetteman hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang ống eppendoft mới (ghi lại số ống).

14. Lặp lại bước 11. 15. Lặp lại bước 12. 16. Lặp lại bước 13.

17. Thêm 1400 µl ethanol 96% (đã làm lạnh) và giữ trong tủ lạnh – 200C qua đêm.

18. Ly tâm 13.500 vòng/phút ở 40C trong 30 phút, loại bỏ cồn giữ lại kết tủa ở dưới đáy ống.

19. Rửa tiếp bằng 400 µlethanol 70% (đã làm lạnh) ly tâm 13.500 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Sau đó đổ ethanol giữ tủa lại.

20. (Lặp lại bước 19).

21. Đổ ethanol giữ tủa lại để khô tự nhiên hoặc cho vào máy ly tâm khô chân không khoảng 10 phút để làm khô DNA.

22. Cho thêm vào mỗi eppendoft 50µl TE (10:0,1) để hòa tan DNA. 23. Giữ DNA trong tủ lạnh – 200C, dùng dần.

Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất.

Bảng 1. Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất

* Đệm CTAB (EB) 500ml

+ CTAB 2% 10 gam CTAB

+ EDTA(pH:8) 0,5M 50ml + NACL 2M 200ml 5M + Tris. Cl (pH = 7.5) 0,2M 100ml 1M(pH = 7,5) isopropanol (2-Propanol) * SDS 10% *β-Mercaptoethanol : 0,2% * TE pH 8 (10:0,1) + 600µl Tris.HCL 1M pH = 8 16

+ 12µl EDTA 0,5M pH = 8 + Thêm dH2O cho đủ V = 60ml.

* RNase – 10mg RNase/10ml H2O đun sôi 10-15 phút, giữ trong -200C. * Hỗn hợp Chloroform: isoamylalcohol (24:1).

* Ethanol tuyệt đối và ethanol 70% giữ ở - 200C.

2.2.2.2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA

Độ tinh sạch DNA của lá Thiên Thảo được kiểm tra bằng cách xác định O.D ở 260nm và O.D ở 280nm trên máy quang phổ kế. Tỷ lệ O.D260/O.D280 trong khoảng từ 1,6-1,8 là DNA đủ độ tinh sạch. Tỷ lệ O.D260/O.D280 nhỏ hơn giới hạn trên thì DNA không tinh sạch mẫu còn lẫn protein hay tạp chất nào đó.

Nồng độDNA được tính theo công thức: DNA =

50 là độ pha loãng, khi mỗi cuvet mẫu đo ta chỉ cho 2µl mẫu.

2.2.2.3. Kỹ thuật phân tích DNA bằng chỉ thị vi vệ tinh (SSR)

- Chuẩn bị gel agarose

Cân 1g agarose, đun sôi trong 100ml 1xTAE cho đến khi agarose tan hết. Để nguội xuống còn 500-600C, cho thêm 4µl EtBr, lắc đều, Đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài lược sẵn, để nguội, rút lược ra.

Đặt khay gel vào bể điện di và cho 1xTAE ngập gel từ 2-3mm.

Tra mẫu điện di: lần lượt tra mẫu vào các giếng điện di (chú ý thứ tự mẫu). Mẫu là DNA trộn với thuốc nhuộm Bromophenol blue 0,25% và nước cho đủ 10µl (2:2:6)

(v/v/v).

Cường độ dòng điện và thời gian chạy điện di phụ thuộc vào mẫu điện di và mục đích sử dụng. Thường để thuốc nhuộm qua giếng 2mm.

Kiểm tra mẫu điện di trên máy soi DNA (tia UV) - Hóa chất:

* 1xTAE được pha từ dịch gốc 20xTAE 20xTAE: + 96,8g Tris base

+ 22,84 ml glacial acetic acid + 40 ml EDTA 0.5M

Chỉnh pH = 8 bằng Acetic acid Thêm H2O khử trùng đủ 1 lít * Thuốc nhuộm Bromophenol Blue 0,25% Bromophenol Blue --- 0,05g 40% Saccharose trong nước ---8g

H2O khử trùng - - - Thêm H2O cho đủ 20ml

Kỹ thuật này được thực hiện theo phương pháp của Phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Khoa thực vật và Thổ nhưỡng, thuộc trường ĐH Công nghệ Texas, ở Hòa Kỳ.

Bảng 2. Thành phần và thứ tự phản ứng PCR - Để làm phản ứng, Pha DNA

khuôn (template) của các mẫu đồng nhất 30ng/lµl.

- Kiểm tra mồi để làm phản ứng, với các mồi còn tốt chỉ dùng 0,32µl (10µM/µl) cho một phản ứng (tổng số 20µl)

- Trình tự primer ITS

ITS 1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS 4 5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-

- Thành phần và thứ tự phản ứng PCR:

- Sau khi làm xong phản ứng ta ly tâm 2000v/phút, cho mẫu lắng xuống bằng máy ly tâm cân bằng. Khi tốc độ đạt 2000v/phút ta lấy ra.

- Tiến hành phản ứng PCR.

Mỗi phản ứng PCR chúng tôi thường chạy 30 chu kỳ. Chường trình chạy phụ thuộc nhiệt độ ủ (annealing) của mồi . Thường nhiệt độ ủ là 550, ta có chương trình cài đặt như sau:

Bảng 3. Chương trình cài đặt các bước

(Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT. Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011) 18 Thành phần Thứ tự Thêm vào Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng Nước cất 2 lần đã khử ion, khử trùng 1 X 5xPCR Buffer (với dNTP, mỗi loại 10µl

+ 10µl BSA +450 µl dH2O) 2 4 *1x(dNTP= 200µl) MgCl2 3 0,64 15mM Mồi thuận (10µM) 4 y 0,2µM Mồi nghịch (10µM) 5 0,2µM

TaqDNA polymerase (5units/µl) 6 0,3 1.5 Units

ADN khuôn (30ng/µl) 7 3 90ng/20µl

Tổng thể tích 20µl

Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ

I 940 5’ 1 II 950 1:30’’ 30 550 1:30’’ 720 1:30’’ III 720 5’ 1

Trường hợp nhiệt độ ủ là 600C hay 630C ta chỉ thay đổi nhiệt độ ủ 550C ở bước II thành 600C hay 630C.

2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Phân tích phân ly di truyền

Các số liệu phân tích phân ly di truyền tính trạng kháng rầy được xử lý thống kê (Gomez and Gomez, 1984) theo phép thử “x2”.

Như vậy ở đây, khi có 2 lớp phân ly (m=2), ta có: X2=

Còn trong trường hợp có trên 2 lớp phân ly (m>2), ta có: X2=

Trong đó: i= 1, 2, …., m m là số lớp phân ly

Qi là tần số quan sát thực tế của lớp i Li là tần số xuất hiện lý thuyết của lớp i

Từ giá trị « X2 tìm được , tra bảng thống kê để tìm giá trị P tương ứng. Nếu P>0,05 thì tỉ lệ phân ly thực nghiệm được coi là phù hợp với lý thuyết.

Tương dồng di truyền và khoảng cách di truyền

Phân tích mức tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo chương trình PopGene, theo công thức của Nei (1972) [146] :

I= và D = - ln (I)

Trong đó : I – mức tương đồng di truyền D – khoảng cách di truyền giữa 2 mẫu q12 – số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu

Q1 và Q2 tổng số các alen của mẫu 1 và mẫu 2. Phân tích liên kết

Phân tích liên kết các chỉ thị phân tử với locut gen kháng rầy nâu và định vị các locut gen kháng rầy nâu trên nhiễm sắc thể của lúa được tiến hành theo chương trình máy tính MapMarker.

2.2.2.5. Giải trình tự DNA và xác định gen ITS

Kỹ thuật nàydựa trên phương pháp Sanger (Sanger er al.,1977). Mỗi loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. Nhờ vậy các oligonucleotid cuùng chấm dứt tại một dideoxxynucleotid sẽ có cùng một màu. DNA được giải trình tự bởi công ty DNA Sequencing ServicesGeneral Order Information, Hàn Quốc trên máy đọc trình tự tự động.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT

2.3.1. Nghiên cứu lý thuyết

- Phương pháp thu thập thông tin, phân tích, so sánh, tổng hợp. - Phân loại thông tin nghiên cứu.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tài liệu

- Nội dung cần thu thập trong quá trình nghiên cứu tài liệu.

- Nguồn tài liệu: các Bài báo, Hội thảo khoa học, Giáo trình Hóa sinh, các Luận văn và Luận án khoa học liên quan đến cây Phước lộc thọ, các trang Web liên quan

- Phân tích tài liệu. - Tổng hợp tài liệu.

2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

- Các thông tin được thu thập phải đảm bảo chính xác, có độ tin cậy cao nhất..

- Kết quả của nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến hoạt động kinh doanh và sản xuất của các cơ quan nghiên cứu.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI

Mẫu cây Thiên Thảo được thu thập tại An Giang ở vị trí: - Kinh độ: …. - Vĩ độ: …… Loài (species):… Chi (genus): … Họ (familia): …. Bộ (ordo):… Lớp: Giới (regnum): Tên khác: 3.1.1. Thân. 3.1.2. Lá 3.1.3. Rễ 3.1.4. Hoa 3.1.5. Quả 3.1.6. Hạt

3.2. HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 3.2.1. Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn

3.2.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn

3.2.2.1. Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR

3.2.2.2. Thành phần và thứ tự phản ứng PCR: 3.2.2.3. Tiến hành phản ứng PCR.

3.2.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA

3.3. KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RIỀNG NẾP

3.3.1. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA3.3.2. Kết quả giải trình tự gen DNA 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen DNA

3.3.3. Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI

3.4. MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY THIÊN THẢO THẢO

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Quá trình nghiên cứu, tổng hợp tài liệu qua các báo cáo khoa học của đã khẳng định.

4.1.1.Mẫu cây Thiên Thảo được thu thập tại An Giang ở vị trí:

- Kinh độ: - Vĩ độ: Tên khoa học: Loài (species): Chi (genus): Họ (familia): Lớp:

Giới (regnum): Plantae.

Tên khác:

Đặc điểm chỉ thị hình thái thu được phù hợp với cây Thiên Thảo mô tả trong đề tài.

Thân Lá Rễ Hoa Quả Hạt Kết luận:

4.1.2. Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA và chu kỳ PCR cây Thiên Thảo Thảo

-

4.1.3. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA cây Thiên Thảo và trình tự gen của cây này

-

4.2. KIẾN NGHỊ

- Nhà trường tạo điều kiện để chúng em nghiên cứu sâu thêm về dược liệu cây Phước lộc thọ ở Đồng bằng sông Cửu Long.

- Tiếp tục xây dựng thêm chỉ thị phân tử cho nguồn dược liệu ở Đồng bằng sông Cửu Long.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

22

1. Basilicum polystachyon (L.) Moench a Rare Mint in Taiwan, Department of Biological Sciences and Technology, National University of Tainan, Tainan, Taiwan, 2017.

2. Bộ Y Tế, 2006. Giáo trình Dược cổ truyền.Nhà xuất bản Y học. Tr. 358

3. Bộ Y Tế, 2018. Dược điển Việt Nam 5. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Tr. 1154- 1156

4. Bộ Y tế, 2018. Dược Điển Việt Nam 4. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Tr. 606-607- 608.

5. Bộ Y tế, 2018. Dược Thư Quốc Gia Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Tr. 3081-3087.

6. Nguyễn Đức Thành, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, Tạp chí sinh học Các kĩ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật, 2014.

7. Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006. Các phương pháp nghiên cứu thực vật. NXB Giáo Dục. 8. Pharmacognostical studies on the leaves of Basilicum polystachyon Moench / Asian Journal of Traditional Medicines, 2013.

9. The journal of economy, environment and society, JEES Vol. 2 Issue 2/ Singh, V.K., Chaudhuri, S., Maiti, G.G. & Mandal, M . 2018.

10. Trang web https://thongtinthuoc.org/cay-thien-thao.html truy cập ngày 29 tháng 9 năm 2021.

11. Trang web https://www.academia.edu/download/38604710/basilicum.pdf truy cập ngày 29 tháng 9 năm 2021.

12. Trang web https://amp.thaythuoccuaban.com/vithuoc/caythienthao.htm truy cập ngày 29 tháng 9 năm 2021.

PHỤ LỤC

Phụ lục B. Quy trình ly trích DNA

Tách chiết DNA:

- Nghiền 200l mẫu trong túp eppendorf bằng máy nghiền. - Thêm 1ml dung dịch trích (EB) và 50l SDS (10%). - Ủ 65 trong 30’ (5’ đảo nhẹ)

- Li tâm 13.000rpm trong 10’.

- Chuyển phần trong (800l) vào túp mới và thêm một lượng tương đương Isopropanol, ủ 2 giờ ở -20oC.

- Li tâm 13.000rpm trong 10’, hoà tan DNA trong 400 l TE. - Thêm 10l Rnase (10mg/ml) ủ ở 37 trong 15’.

- Thêm 400l CTAB buffer và ủ ở 65 trong 15’, thỉnh thoảng đảo ngược ống túp để trộn đều.

- Thêm 800l Chloroform/Isoamylalcohol (24:1) và trộn đều.Litâm 13.000rpm trong 5’. - Chuyển phần dung dịch trong qua túp 2.2 ml mới, thêm 1ml Ethanol 96% và ủ ở nhiệt

độ phòng trong 15’.

- Li tâm 13.000rpm trong 10’, đổ bỏ phần trong và rửa phần cặn với ethanol 70% bằng 700l.Li tâm lần nữa để loại bỏ ethanol.

- Để vào máy li tâm chân không 45 trong 10’. - Hoà tan DNA trong 200l TE 0.1.

(Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT. Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011)

Phản ứng PCR

Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi (White et al., 1990) có trình tự sau:

ITS 1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS 4: 5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’

Quá trình thực hiện phản ứng PCR:

Hóa chất Thể tích (µl)

H20 34,5

PCR buffer (10X Taq buffer