DES có áp suất hơi bão hòa thấp nên khó có thể sử dụng phương pháp cất dưới áp suất giảm để tách các chất tan không bay hơi ra khỏi dung môi. Hiện nay có 3 phương pháp chính để tách riêng hoạt chất và DES bao gồm chiết lỏng - lỏng, chiết rắn - lỏng, sử dụng phản dung môi (antisolvent) [61].
1.3.7.1. Chiết lỏng - lỏng
DES có thể trộn lẫn với các dung môi phân cực như MeOH, EtOH, nước và không trộn lẫn với các dung môi không phân cực, ví dụ toluen, hexan, ethyl acetat, acetonitril, diethyl ether… Do đó có thể sử dụng một trong những dung môi không phân cực này để thu lấy các hợp chất mong muốn. Khả năng tạo liên kết hydro của các hợp chất chiết được càng thấp thì càng dễ chiết từ pha DES. Tuy nhiên, nếu chỉ chiết phân bố 1 lần thì lượng hợp chất thu được là rất thấp. Vì vậy, cần chiết phân bố nhiều lần và/hoặc chiết với lượng lớn dung môi để thu được các hợp chất phenolic một cách hiệu
17
quả. Ưu điểm của phương pháp này là có thể thu hồi được dung môi DES để sử dụng trong lần chiết xuất tiếp theo [61].
1.3.7.2. Chiết rắn - lỏng
Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng nhựa để hấp phụ hợp chất cần tách. Sau đó rửa giải bằng EtOH hoặc MeOH. Làm bay hơi EtOH hoặc MeOH để thu hợp chất mong muốn [61, 70].
1.3.7.3. Sử dụng phản dung môi
Khi thêm một lượng lớn phản dung môi (thường là nước, ngoài ra còn có thể sử dụng ethanol) vào DES, các thành phần trong DES sẽ hòa tan hoàn toàn trong phản dung môi, làm phá vỡ các tương tác giữa HBA và HBD, từ đó làm mất đặc tính của DES. Do đó có thể tách các hợp chất chiết được do sự hình thành kết tủa hoặc tạo thành một lớp không tan trong nước hoặc EtOH [61]. Một số nghiên cứu đã tiến hành tách các hợp chất phenolic từ DES bằng cách thêm nước vào dịch chiết với tỉ lệ 20:1 và để kết tinh ở 0°C trong 2-4 giờ sau đó lọc lấy cắn [30, 52]. DES được tái sử dụng bằng cách làm bay hơi nước hoặc EtOH [61].
So với 2 phương pháp trên, phương pháp sử dụng phản dung môi có ưu điểm không cần sử dụng các loại thiết bị chiết phân bố, nhựa hay các dung môi hữu cơ. Tuy nhiên phương pháp này không thể áp dụng với những hợp chất tan trong nước.
18
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là dược liệu cúc hoa vàng được thu hái vào tháng 3 năm 2021 tại làng Nghĩa Trai, xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên. Dược liệu sau khi thu hái được phơi khô, để nơi khô ráo thoáng mát.
Mẫu cây có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Bảo tàng sinh học, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với số hiệu tiêu bản HNU 027737. Dựa vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, sử dụng khóa phân loại chi
Dendranthema, đối chiếu với bản mô tả loài theo tài liệu Flora of China [62], Flora of Hong Kong [20] và Thực vật chí Việt Nam [2], dưới sự hướng dẫn của Giáo sư Phan Kế
Lộc, mẫu nghiên cứu được xác định tên khoa học là Dendranthema indicum (L.) Des Moul., tên đồng nghĩa là Chrysanthemum indicum L., họ Cúc (Asteraceae).
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, phần mềm
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có: - Dung môi: Methanol, ethanol, acetonitril (HPLC), ethyl acetat.
- Hóa chất: Cholin clorid, betain, lactose, glucose, saccharose, acid citric, propylen glycol, acid acetic, glycerin.
- Chất chuẩn: Apigenin độ tinh khiết 98,03% và luteolin độ tinh khiết 99,55% được cung cấp bởi công ty Biopurify Phytochemicals Ltd.
2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ
- Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ), độ chính xác 0,1 mg.
- Cân kỹ thuật Sartorius TE 3102S (Đức), độ chính xác 0,01 g. - Máy xác định hàm ẩm Ohaus (Trung Quốc).
- Tủ sấy Menmert (Đức).
- Máy siêu âm Sonic vibra cell (Mỹ). - Bể cách thủy điều nhiệt Memmert (Đức).
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản) gồm: bơm LC-20AD, detector DAD SPD-M20A, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20C, bộ phận điều nhiệt CTO-20A; cột sắc ký Phenomenex C18 (kích thước 250 mm × 4,6 mm; kích thước hạt 5µm).
19
- Màng lọc 0,45 µm.
- Các dụng cụ sử dụng lấy mẫu và thí nghiệm: pipet pasteur; pipet chính xác 1 ml, 2 ml, 5 ml; bình định mức 100 ml, 50 ml, 10 ml; bình gạn 150 ml, phễu, bông lọc, ống nghiệm, cốc có mỏ, quả bóp cao su.
2.1.2.3. Phần mềm
- Phần mềm Design Expert 11.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Để giải quyết các mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
- Nội dung 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin
trong dịch chiết cúc hoa vàng.
- Nội dung 2. Khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic để điều chế cao đặc giàu
apigenin và luteolin từ cúc hoa vàng.
- Nội dung 3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho
quá trình điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ cúc hoa vàng.
- Nội dung 4. Khảo sát và lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc giàu apigenin
và luteolin từ dịch chiết cúc hoa vàng trong DES.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình dự kiến điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ cúc hoa vàng
Cân chính xác khoảng 0,2000 g cúc hoa vàng đã được xay nhỏ đến kích thước thích hợp vào ống nghiệm, thêm chính xác 4 ml dung môi và chiết ở nhiệt độ, thời gian tương ứng theo thiết kế thí nghiệm. Dịch chiết được lọc qua bông và sau đó được loại dung môi, thu lấy cao đặc bằng phương pháp thích hợp.
2.3.2. Phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết cúc hoa vàng
Dịch chiết cúc hoa vàng sau khi được lọc qua bông được tiếp tục lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký như sau [58]:
- Cột sắc ký: Shim-pack GIS C18 (250 mm 4,6 mm; 5 m). - Pha động: Acetonitril : acid phosphoric 0,1% tỉ lệ 40 : 60. - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Nhiệt độ: 30°C.
20
Phương pháp được thẩm định đầy đủ về độ đặc hiệu, sự phù hợp của hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng.
2.3.3. Phương pháp điều chế hệ dung môi eutectic
2.3.3.1. Phương pháp điều chế hệ dung môi eutectic
Phối hợp các thành phần HBA, HBD và nước theo các tỉ lệ thích hợp, sau đó đun nóng kết hợp khuấy trộn đến khi tạo thành chất lỏng trong suốt đồng nhất. Để nguội đến nhiệt độ phòng thu được hệ dung môi eutectic. Loại bỏ những hệ dung môi không thể tạo thành chất lỏng trong suốt đồng nhất trong quá trình bào chế hoặc kết tinh lại tại nhiệt độ phòng. Những hệ dung môi đồng nhất sẽ được tiếp tục sử dụng cho các thí nghiệm sau.
2.3.3.2. Khảo sát hệ dung môi eutectic
Mẫu đối chiếu: Cân chính xác khoảng 0,2000 g dược liệu vào ống nghiệm sau đó thêm
vào chính xác 4 ml methanol hoặc ethanol 70% hoặc nước. Tiến hành chiết nóng ở nhiệt độ 60°C trong 20 phút. Dịch chiết được lọc qua bông và sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm.
Mẫu thử: Sử dụng các hệ dung môi eutectic đồng nhất được điều chế ở mục 2.3.3.1.
Cân chính xác khoảng 0,2000 g dược liệu vào ống nghiệm sau đó thêm vào chính xác 4 ml dung môi eutectic. Tiến hành chiết nóng ở nhiệt độ 60°C trong 20 phút. Dịch chiết được lọc qua bông và và sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm.
Tiến hành sắc ký lỏng mẫu đối chiếu và các mẫu thử. Hàm lượng apigenin hoặc hàm lượng luteolin ở mẫu thử và mẫu đối chiếu được tính theo công thức:
Yi (mg/g) = (𝑆−𝑏).𝑉.100 𝑎.𝑚.(100−𝐴%).1000
Trong đó:
Yi: hàm lượng apigenin (Y1) hoặc hàm lượng luteolin (Y2) trong dịch chiết tính theo mg/g dược liệu khô
S: diện tích pic (µAU.s)
b: hệ số chặn của đường chuẩn V: thể tích mẫu thử (ml) a: hệ số góc đường chuẩn m: khối lượng dược liệu (g)
21
Mẫu thử có hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin cao nhất sẽ được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu.
2.3.4. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
2.3.4.1. Các yếu tố khảo sát và các thông số đánh giá
a. Các yếu tố khảo sát
- Nhiệt độ chiết xuất: 30°C, 50°C, 70°C, 90°C.
- Thời gian chiết xuất: 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút, 80 phút. - Hàm lượng nước trong DES: 10%, 20%, 30%, 40%.
- Tỉ lệ dược liệu/dung môi: 2/40 g/ml, 3/40 g/ml, 4/40 g/ml. b. Các thông số đánh giá
Thông số đánh giá là hàm lượng apigenin trong dịch chiết (Y1) và hàm lượng luteolin (Y2) trong dịch chiết cúc hoa vàng.
2.3.4.2. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất được khảo sát dựa trên hai phương pháp: phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT- One factor at a time) và phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM - Response surface methodology).
a. Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Thực hiện các thí nghiệm thay đổi 1 yếu tố trong khi cố định 3 yếu tố còn lại để khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố lên quá trình điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ cúc hoa vàng. Từ kết quả khảo sát, yếu tố ít ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất sẽ được cố định ở 1 giá trị nhất định, các yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết xuất sẽ được lựa chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
b. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Lựa chọn biến đầu vào
Các yếu tố được lựa chọn từ kết quả khảo sát bằng phương pháp thay đổi một yếu tố là biến đầu vào trong phương pháp bề mặt đáp ứng. Khoảng khảo sát của các yếu tố này được xác định dựa vào kết quả khảo sát ở trên. Mỗi biến đầu vào được mã hóa ở 3 mức -1, 0 và +1
Lựa chọn biến đầu ra
Biến đầu ra là hàm lượng apigenin (Y1) và hàm lượng luteolin (Y2) trong dịch chiết cúc hoa vàng.
22
Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng phần mềm Design Expert 11, 20 thí nghiệm theo mô hình phức hợp trung tâm (CCD - Central Composite Design) kiểu hướng mặt (=1, face-centered) được xác định để tối ưu hóa quá trình điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ cúc hoa vàng.
Xây dựng và đánh giá mô hình
Dựa trên kết quả thực nghiệm thu được từ 20 thí nghiệm đã xây dựng, tiến hành xây dựng mô hình bằng phương pháp Hồi quy tuyến tính đa biến (MLR - Multivariable
Linear Regression) sử dụng phần mềm Design Expert 11. Mô hình biểu thị sự ảnh hưởng
của biến đầu vào đến hàm lượng apigenin (Y1) và hàm lượng luteolin (Y2) trong dịch chiết cúc hoa vàng có phương trình tổng quát như sau:
Y = f(X1, X2, X3) = 0 + ∑n 𝑖 i=1 × Xi + ∑n 𝑖𝑗 i,j=1 i<j × Xi × Xj + ∑n 𝑖𝑖 i=1 × Xi2 + ɛ Trong đó: Y: biến đầu ra
Xi, Xj: biến đầu vào n: số biến đầu vào
0, i, ij, ii: các hệ số của phương trình hồi quy ɛ: sai số hoặc nhiễu quan sát được của biến đầu ra
Mô hình được đánh giá về độ phù hợp với kết quả thực nghiệm và khả năng dự đoán dựa trên hệ số xác định R2, hệ số xác định hiệu chỉnh R2adj, hệ số xácđịnh dự đoán R2
pred, hệ số biến thiên CV%, độ chính xác đầy đủ.
Lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu
Điều kiện chiết xuất tối ưu được xác định bằng phương pháp hàm kỳ vọng, sử dụng phần mềm Design Expert 11.
Thẩm định mô hình
Tiến hành thẩm định lại mô hình bằng cách thực hiện thí nghiệm tại điều kiện tối ưu (lặp lại 3 lần) và so sánh với giá trị dự đoán bởi mô hình.
23
2.3.5. Phương pháp điều chế cao đặc từ dịch chiết DES
Cao đặc giàu apigenin và luteolin được điều chế từ dịch chiết cúc hoa vàng trong DES bằng các phương pháp: sử dụng phản dung môi, chiết lỏng - lỏng, chiết rắn - lỏng. Hiệu quả của quá trình điều chế cao đặc được đánh giá dựa trên 3 thông số: tỉ lệ khối lượng % cao thu được (%), hàm lượng apigenin trong cao (mg/ml) và hàm lượng luteolin trong cao (mg/ml).
- Tỉ lệ khối lượng % cao thu được được tính theo công thức: Tỉ lệ khối lượng % cao = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑑ượ𝑐 𝑙𝑖ệ𝑢 × 100
- Hàm lượng apigenin trong cao (mg/g) và hàm lượng luteolin trong cao (mg/g) được tính theo công thức:
Ai = (𝑆−𝑏).𝑉 𝑎.𝑚.1000
Trong đó:
Ai: hàm lượng apigenin trong cao (mg/g) hoặc hàm lượng luteolin trong cao (mg/g)
S: diện tích pic (µAU.s)
b: hệ số chặn của đường chuẩn V: thể tích dịch chiết (ml) a: hệ số góc đường chuẩn m: khối lượng cao (g)
Trên cơ sở đó, lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc phù hợp để xây dựng quy trình chiết xuất hoàn chỉnh.
Sau khi lựa chọn được quy trình điều chế cao đặc, tiến hành xác định độ ẩm của cao. Yêu cầu độ ẩm của cao đặc nhỏ hơn 20% [3].
24
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin từ dịch chiết cúc hoa vàng
Hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết cúc hoa vàng được xác định bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký được trình bày ở mục 2.3.2. Phương pháp được thẩm định về độ đặc hiệu, sự phù hợp của hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Kết quả thẩm định được trình bày chi tiết ở Phụ lục 2 và được tóm tắt ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin
trong dịch chiết cúc hoa vàng
STT Tiêu chuẩn Kết quả
Apigenin Luteolin
1 Sự phù hợp của hệ thống
RSD (diện tích pic): 1,68% RSD (thời gian lưu): 0,20%
RSD (diện tích pic): 1,49% RSD (thời gian lưu): 0,06%
2 Khoảng tuyến tính Y = 116907,3427 X + 104787,6691 Y: Độ hấp thụ tại bước sóng 335 nm Y: Nồng độ apigenin trong dịch chiết (µg/ml) R2 = 0,9998 Y = 68121,9382 X + 41266,6025 Y: Độ hấp thụ tại bước sóng 335 nm Y: Nồng độ luteolin trong dịch chiết (µg/ml) R2 = 0,9998 3 Độ lặp lại RSD: 3,33% RSD: 1,95% 4 Độ đúng % trung bình tìm lại: 100,75% % trung bình tìm lại: 99,61%
Nhận xét: Phương pháp định lượng được thẩm định đạt yêu cầu về độ đặc hiệu,
sự phù hợp với hệ thống, khoảng tuyến tính, có độ đúng và độ lặp lại cao. Phương pháp này có thể được sử dụng để định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết cúc hoa vàng.
3.2. Kết quả khảo sát và lựa chọn hệ dung môi chiết xuất
Tiến hành chuẩn bị 32 hệ dung môi DES bằng cách phối hợp hai chất HBA và HBD theo các tỉ lệ mol khác nhau, thêm nước (30% theo khối lượng) sau đó đun nóng, khuấy đều đến khi tạo thành chất lỏng trong suốt đồng nhất. Để nguội ở nhiệt độ phòng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
25
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eutectic đồng nhất
STT Ký hiệu hệ DES HBA HBD Tỉ lệ HBA:HBD Dung môi đồng nhất
1 1a Cholin clorid Lactose 8:1 +
2 1b Cholin clorid Lactose 4:1 -
3 2a Cholin clorid Glucose 8:1 +
4 2b Cholin clorid Glucose 4:1 +
5 3a Cholin clorid Saccharose 8:1 +
6 3b Cholin clorid Saccharose 4:1 +
7 4a Cholin clorid Acid citric 1:1 +
8 4b Cholin clorid Acid citric 2:1 +
9 5a Cholin clorid Propylen glycol 1:4 +
10 5b Cholin clorid Propylen glycol 1:2 +
11 6a Cholin clorid Acid acetic 1:2 +
12 6b Cholin clorid Acid acetic 1:4 +
13 7a Cholin clorid Glycerin 1:2 +
14 7b Cholin clorid Glycerin 1:1 +
15 1’a Betain Acid citric 1:1 +
16 1’b Betain Acid citric 2:1 -
17 1’c Betain Acid citric 1:2 +
18 2’a Betain Propylen glycol 1:4 +
19 2’b Betain Propylen glycol 1:2 -
20 2’c Betain Propylen glycol 1:8 +
21 3’a Betain Acid acetic 1:4 -
22 3’b Betain Acid acetic 1:8 +
23 3’c Betain Acid acetic 1:16 +