Tiến hành phân lập chất từ cao chiết phân đoạn ethyl acetat của hành Lý sơn.
Chuẩn bị mẫu: 33,16 g cao ethyl acetat được tẩm với lượng silica gel vừa đủ. Chuẩn bị cột sắc ký: cột thủy tinh được làm sạch treo trên giá thẳng đứng, dài 80
cm, đường kính 7 cm, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột.
Chuẩn bị chất nhồi cột: chất nhồi cột là silica gel pha thuận, kích thước hạt 0,040
- 0,063 mm (Merck). Silica gel được ngâm với dicloromethan.
Nhồi cột: cho chất nhồi cột vào cột. Sau khi đưa hết silica gel lên cột, tiếp tục gõ
nhẹ, đều và đối xứng xung quanh thân cột tới khi bề mặt lớp silica gel ổn dịnh. Cho dung môi chảy qua cột trong vòng 15 phút để ổn định cột.
1. Chiết phân đoạn với EtOAc, 3 lần x 1 lít/ lần. 2. Cất thu hồi dung môi EtOAc.
Dịch chiết nước Cao EtOAc (36,35 g)
Cắn nước (450,06 g) 3,5 kg dược liệu khô
Cao tổng EtOH 90% (605, 29 g)
1. Chiết ngâm với EtOH 90% với tỷ lệ 7:1 (dm/ dl) ở nhiệt độ phòng, 2 lần x 24h/ lần.
2. Lọc, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi.
Lưu làm đối chiếu (9,92 g) 1. Phân tán cao tổng trong 1 lít nước nóng
2. Chiết phân đoạn với n- hexan, 3 lần x 1 lít/ lần. 3. Cất thu hồi dung môi n- hexan.
24
Nạp mẫu: tiến hành nạp mẫu theo phương pháp nạp mẫu khô. Sau khi ổn định
cột, bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 cm thì cho từ từ mẫu lên cột. Dùng một lớp bông để bảo vệ bề mặt cột.
Dung môi khai triển: hệ dung môi gradient dicloromethan – methanol (100:1 –
1:100, tt/tt).
Tiến hành: Triển khai sắc ký với hệ dung môi đã chọn, thu dịch rửa giải vào các
bình nón thể tích 250 ml được các phân đoạn riêng biệt, mỗi phân đoạn 100 ml. Khảo sát dịch rửa giải thu được bằng SKLM, gộp dịch các bình có sắc ký đồ giống nhau, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn nhỏ.
Kết quả: Thu được 11 phân đoạn, ký hiệu là E1, E2, E3, …, E11.
Phân đoạn E4 (3,91 g) tiếp tục được phân lập bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi diclomethan – ethyl acetat (50:1 – 0:100, tt/tt) thu được hợp chất AA1 (20 mg).
Phân đoạn E6 (3,24 g) xuất hiện kết tủa màu vàng, rửa tủa và kết tinh lại nhiều lần với hệ dung môi diclomethan - methanol (80:1, tt/tt) thu được hợp chất AA2 (50 mg).
Phân đoạn E8 (1,27 g) được phân lập bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi methanol – nước (1:2, tt/tt) thu được hợp chất là AA4 (10 mg).
Quá trình phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat được thể hiện ở hình 3.3:
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất từ hành Lý Sơn
Sắc ký đồ TLC của các hợp chất AA1, AA2, AA4 so với cao chiết ethyl acetat được thể hiện ở hình 3.4:
Cao ethyl acetat (36,35 g)
CC, D-M gradient
E1, E2, E3
E5, E7, E10, E11 E4
E6 Rửa tủa, D-M (80:1, tt/tt) AA1 (20 mg) AA2 (50 mg) CC, D-E (50:1-0:100, tt/tt) E8 AA4 (10 mg) CC, M-W (1:2, tt/tt)
25
Hình 3.4: Sắc ký đồ của hợp chất AA1, AA2, AA4 so với các cao chiết
T: Cao tổng, E: Cao ethyl acetat
Hệ dung môi diclomethan:methanol (10:1, tt/tt)
Hình ảnh quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm (A), ánh sáng thường sau khi nhúng dung dịch acid sulfuric10% trong ethanol 96% (TT) và sấy nóng
ở 105oC (B) và ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm (C).
Như vậy, ba hợp chất gồm AA1 (20 mg), AA2 (50 mg) và AA4 (10 mg) đã được phân lập từ cao chiết ethyl acetat của dược liệu hành Lý Sơn. Các hợp chất này được kiểm tra tính chất vật lý và dữ liệu các phổ NMR, MS để xác định cấu trúc hóa học.