Các tiêu chí thẩm định quy trình định lượng THP trong chế phẩm được thực hiện theo AOAC (2016).
a) Độ phù hợp hệ thống
Tiêu chí thẩm định phép thử định lượng. Được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu chuẩn. Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau: RSD ≤ 1% (tR) và RSD ≤ 2% (Spic).
b) Độ đặc hiệu
Tiêu chí thẩm định phép thử định tính và định lượng.
Độ đặc hiệu là khả năng nhận biết các mẫu trong một hỗn hợp. c) Độ tuyến tính
Tiêu chí thẩm định phép thử định lượng. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Yêu cầu cần đạt được:
+ Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn trong khoảng ± 15% trong đó Y= 𝐶𝑡−𝐶𝑐
𝐶𝑐 × 100%, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%. d) Độ lặp lại
Tiêu chí thẩm định phép thử định lượng. Độ lặp lại là mức độ gần nhau giữa các kết quả riêng lẻ của các phép đo theo đúng quy trình thử nghiệm lặp lại, và được biển diễn bằng độ lệch chuẩn tương đối. Yêu cầu: RSD ≤ 2.7% [9]
e) Độ đúng
Tiêu chí thẩm định phép thử định lượng. Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Xác định độ đúng dựa vào độ thu hồi: Thêm một lượng xác định chất chuẩn vào các mẫu thử, tiến hành 6 mẫu. Tiến hành phân tích sắc kí các mẫu thêm chuẩn, sau đó tính độ thu hồi theo công thức:
R%= 𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎê𝑚 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛−𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎử
𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑡ℎê𝑚 × 100%
Yêu cầu: Độ thu hồi trong khoảng từ 90%-107% [9] f) Giới hạn phát hiện (LOD)
Tiêu chí thẩm định phép thử định tính và định lượng. Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được không lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được.
Với phép thử định lượng, xác định LOD dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). LOD được chấp nhận mà tại đó S/N=3
Xác định LOD cho phép thử định tính dựa vào việc phân tích lặp lại 10 lần mẫu chuẩn. Yêu cầu: 100% số lần thử đều phát hiện được vết [8].
g) Giới hạn định lượng (LOQ).
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1 Lựa chọn tiêu chí đánh giá viên nang chứa Lạc tiên và Bình vôi
Dựa trên chuyên luận chung viên nang, chuyên luận riêng của dược liệu Bình vôi và Lạc tiên của Dược Điển Việt Nam V kết hợp với Thông tư 43/2014/TT-BYT quy định về quản lý thực phẩm chức năng, tôi lựa chọn một số tiêu chí sau để đánh giá chất lượng chế phẩm:
1. Định tính THP và Bình vôi 2. Định tính VTX và Lạc tiên 3. Mất khối lượng do làm khô 4. Giới hạn kim loại nặng
5. Giới hạn nhiễm khuẩn 6. Định lượng THP 7. Định lượng VTX
Các chỉ tiêu từ 1 đến 6, phương pháp kiểm nghiệm được tham khảo từ Dược Điển Việt Nam V, các quy trình xử lý mẫu được điều chỉnh cho phù hợp với chế phẩm nghiên cứu. Với tiêu chí 7, chưa có phương pháp định lượng trong Dược Điển Việt Nam V nên nhóm nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định bằng HPLC trong một nghiên cứu trước với điều kiện được trình bày như trong Chương 2.
3.2 Thử nghiệm khả thi và thẩm định phương pháp kiểm nghiệm
3.2.1 Kết quả định tính
3.2.1.1 Định tính Tetrahydropalmatin
Kết quả sắc kí đồ định tính Tetrahydropalmatin trong chế phẩm được trình bày ở Hình 3.1 (A, B)
Trên bản mỏng khi soi UV, ở các dải khai triển dược liệu Bình vôi, chế phẩm và bán thành phẩm có xuất hiện các vết màu đen nhạt (ở bước sóng 254 nm) và các vết phát huỳnh quang màu xanh lá (ở bước sóng 366 nm) đều có giá trị Rf = 0,89 tương đương với vết xuất hiện trong dải khai triển chất chuẩn THP. Điều đó chứng tỏ trong chế phẩm, cao dược liệu và dược liệu Bình vôi có chứa THP nhưng hàm lượng THP trong chế phẩm và bán thành phẩm khá nhỏ do cường độ màu của vết mờ.
3.2.1.2 Định tính Vitexin
Tiến hành phân tích sắc kí các mẫu theo hệ pha động Dược điển Việt Nam V [4] thu được các kết quả sắc kí đồ như Hình 3.2 (A, B, C).
Hình 3.2: Sắc kí đồ khảo sát hệ pha động định tính Vitexin theo điều kiện DĐVN. A. Soi đèn UV-254 nm. B. Soi đèn UV-366 nm.
C. Phun thuốc thử hiện màu, soi đèn UV-366 nm.
Nhận thấy rằng, ở bước sóng 366 nm vết Vitexin chỉ phát huỳnh quang khi phun thuốc thử, đồng thời trong chế phẩm và cao dược liệu không xuất hiện vết có Rf tương đương với vết xuất hiện trong dải khải triển chất chuẩn và dược liệu Lạc tiên (Rf = 0,76). Chúng tôi cho rằng hàm lượng Vitexin trong chế phẩm quá nhỏ, không đủ để hiện màu hoặc do trong chế phẩm/ bán thành phẩm chứa nhiều loại dược liệu và tạp chất hơn nên hệ pha động tham khảo từ DĐVN không phù hợp để tách Vitexin ra khỏi hỗn hợp nhiều thành phần. Chúng tôi tiến hành thử hệ pha động: ethylacetat - methanol - nước cất - acid formic
Hình 3.3: Sắc kí đồ khảo sát hệ pha động định tính Vitexin theo điều kiện [26]. A. Soi đèn UV-254 nm. B. Soi đèn UV-366 nm.
C. Phun thuốc thử hiện màu, soi đèn UV-366 nm.
Nhận thấy xuất hiện các vết màu đen nhạt (ở bước sóng 254 nm) và các vết phát huỳnh quang màu xanh lá khi phun thuốc thử (ở bước sóng 366 nm) đều có Rf = 0,83 trên các dải khai triển của chuẩn Vitexin, dược liệu Lạc tiên và chế phẩm. Tuy nhiên, màu xanh phát huỳnh quang của vết chế phẩm không hoàn toàn giống với màu của vết chuẩn và vết dược liệu Lạc tiên. Điều đó có thể do trong chế phẩm có Vitexin và các chất có cấu trúc giống Vitexin.
3.2.1.3 Thẩm định phương pháp định tính a. Độ đặc hiệu
Chấm lần lượt 4 dung dịch gồm có Bình vôi, chuẩn THP, chế phẩm và cao dược liệu. Tiến hành chạy sắc kí thu được sắc kí đồ như Hình 3.1 (A, B).
Nhận xét: Trong cả 2 sắc kí đồ thu được khi soi dưới đèn UV-254nm và UV-366 nm đều xuất hiện 3 vết trong 3 dung dịch Bình vôi, chế phẩm, cao dược liệu có cùng giá trị Rf
như trong dung dịch chuẩn THP (Rf = 0,89). Phương pháp có độ chọn lọc tốt. b. Giới hạn phát hiện
Tiến hành chấm thử các dung dịch chuẩn THP lần lượt ở các mức nồng độ 65 ppm; 26 ppm; 13 ppm; 6,5 ppm. Mỗi dung dịch chấm 3 lần thu được kết quả như Hình 3.4 (A). Sau đó, tiến hành pha dung dịch chuẩn THP 13 ppm và dung dịch chuẩn THP 6,5 ppm. Mỗi dung
Hình 3.4: Sắc kí đồ các mẫu chuẩn THP soi ở UV-366 nm. A) Ở các nồng độ khác nhau.
B) Ở nồng độ 13 ppm. C) Ở nồng độ 6,5 ppm.
Nhận xét: Trong bản mỏng A, cả 3 vết ở 3 nồng độ 65 ppm, 26 ppm và 13 ppm đều phát huỳnh quang khi soi dưới đèn UV-366 nm, còn vết ở nồng độ THP 6,5 ppm thì không phát hiện được. Trong bản mỏng B và C, 10 lần thử các vết nồng độ 13 ppm đều dương tính khi soi đèn UV ở bước sóng 366 nm, còn các vết nồng độ 6,5 ppm cả 10 lần thử đều âm tính. Do đó, chúng tôi dự đoán LOD là khoảng 13 ppm.
3.2.2 Mất khối lượng do làm khô
• Tiến hành xác định trên 3 mẫu thử • Công thức tính kết quả:
X% = 𝒎 𝒄â𝒏+𝒎 𝒄𝒉é𝒏−𝒎 𝒔𝒂𝒖
𝒎 𝒄â𝒏 × 𝟏𝟎𝟎%
• Yêu cầu: Không quá 5%
Bảng 3.1: Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô STT m cân (g) m chén (g) m sau (g) X% 1 0,0977 24,5155 24,6085 4,81% 2 0,1086 20,9101 21,0142 4,14% 3 0,1029 11,1445 11,2441 3,21% Trung bình 4,05% Kết luận Đạt
3.2.3 Giới hạn nhiễm khuẩn
3.2.4.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí
• Yêu cầu (phụ lục 13.6, DĐVN V): < 104 CFU/ml
• Kết quả mẫu chứng dương dương tính, mẫu chứng âm âm tính. • Kết quả số lượng vi khuẩn ở mẫu được tính theo công thức:
CFU/ml = 𝑺ố 𝒌𝒉𝒖ẩ𝒏 𝒍ạ𝒄 ×Độ 𝒑𝒉𝒂 𝒍𝒐ã𝒏𝒈 ×𝟏𝟎𝟎𝟎
𝟓𝟎
• Kết quả tổng vi khuẩn hiếu khí được trình bày trong Bảng 3.4
Bảng 3.2: Kết quả xác định tổng vi khuẩn hiếu khí
Nồng độ pha loãng
10 100 1000
Mô tả kết quả Không mọc Không mọc Không mọc CFU/ml < 2.102 < 2.103 <2.104 Kết luận CFU/ml Tổng hiếu khí < 2. 102 Kết luận chỉ tiêu < 104. Đạt tiêu chuẩn
3.2.4.2 Tổng nấm men, nấm mốc
• Yêu cầu (phụ lục 13.6, DĐVN V): < 102 CFU/ml
• Kết quả mẫu chứng dương dương tính, mẫu chứng âm âm tính. • Kết quả số lượng nấm ở mẫu được tính theo công thức:
CFU/ml = 𝑺ố 𝒌𝒉𝒖ẩ𝒏 𝒍ạ𝒄 ×Độ 𝒑𝒉𝒂 𝒍𝒐ã𝒏𝒈 ×𝟏𝟎𝟎𝟎
𝟓𝟎
• Kết quả tổng nấm men, nấm mốc được trình bày trong Bảng 3.5
Bảng 3.3: Kết quả xác định tổng nấm men, nấm mốc
Nồng độ pha loãng
0 10 100 1000
Mô tả kết quả Không mọc Không mọc Không mọc Không mọc CFU/ml <2. 101 < 1.102 < 1.103 <1.104 Kết luận CFU/ml Tổng nấm men, nấm mốc < 2. 101 Kết luận chỉ tiêu < 102. Đạt tiêu chuẩn
3.2.4.3 Vi khuẩn Gram âm dung nạp mật
• Yêu cầu (phụ lục 13.6, DĐVN V): < 102 CFU/ml
• Nếu có mọc khuẩn lạc là dương tính, không mọc là âm tính. • Kết quả được trình bày trong Hình 3.6 và Bảng 3.6
Hình 3.5: Hình ảnh cấy mẫu lên môi trường VRBA ở các nồng độ khác nhau. Bảng 3.4: Kết quả xác định VK gram âm dung nạp mật
Kết quả đối với lượng sản phẩm Kết luận số lượng vi khuẩn có trong 1 g sản
phẩm
0,1 g 0,01 g 0,001 g
- - - < 10
• Kết luận: Mẫu đạt chỉ tiêu vi khuẩn gram âm dung nạp mật (<102 vi khuẩn) 3.2.4.4 Vi khuẩn Escherichia coli
• Yêu cầu (phụ lục 13.6, DĐVN V): Không có E. coli
• Kết quả: Âm tính
• Kết luận: Mẫu không chứa vi khuẩn E. coli
3.2.4.5 Vi khuẩn Staphylococcus aureus
• Yêu cầu (phụ lục 13.6, DĐVN V): Không có S. aureus
• Kết quả được thể hiện trong Hình 3.8
Hình 3.7: Hình ảnh cấy mẫu lên môi trường thạch muối mannitol
• Kết quả: Âm tính
• Kết luận: Mẫu không chứa vi khuẩn S. aureus
KẾT LUẬN CHUNG: Mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: Tổng vi sinh vật hiếu khí; Tổng nấm men, nấm mốc; VK Gram âm dung nạp mật; vi khuẩn E. coli; vi khuẩn S. aureus.
3.2.4 Phép thử định lượng THP
3.2.5.1 Lựa chọn điều kiện khảo sát
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Tiến hành chiết mẫu chế phẩm trong dung môi chloroform và hỗn hợp ACN-H2O sau đó thu được các dung dịch chạy sắc kí. Các điều kiện xử lý mẫu được trình bày trong Bảng 3.7.
Bảng 3.5: Các điều kiện xử lý mẫu chế phẩm định lượng
Điều kiện chiết Phương pháp chiết Dung môi chiết Thời gian chiết 1 Chiết siêu âm ACN-H2O (1:1) 10 phút
Các sắc kí đồ thu được như Hình 3.9 (A, B, C).
B THP
THP
Hình 3.8: Kết quả khảo sát các điều kiện sắc kí mẫu
A) Mẫu chiết ACN 10 phút B) Mẫu chiết ACN 30 phút C) Mẫu chiết Chloroform
Kết quả: Sắc kí đồ A là mẫu chiết ACN-H2O (1:1) chưa pha loãng và sắc kí đồ B là mẫu chiết ACN-H2O (1:1) pha loãng 10 lần, diện tích pic của THP tương đương với nhau (Spic(A) = 2461,47 và Spic (B) = 245,9). Sắc kí đồ B là mẫu chiết ACN-H2O (1:1) và sắc kí đồ C là mẫu chiết chloroform cùng nồng độ nhưng diện tích pic của mẫu chiết chloroform chỉ bằng 3/5 lần so với mẫu chiết ACN-H2O (1:1).
Nhận xét: Kết quả thu được từ 3 sắc kí đồ có thể nhận thấy rằng, hiệu suất chiết chế phẩm trong ACN-H2O (1:1) cao hơn trong khi chiết chloroform và thời gian chiết trong ACN- H2O (1:1) có ảnh hưởng không đáng kể tới hiệu suất chiết.
Kết luận: Lựa chọn phương pháp chiết mẫu trong hỗn hợp ACN-H2O (1:1) trong 10 phút. Với quy trình cụ thể như sau:
Cân chính xác một lượng mẫu khoảng 0,05 g cho vào bình nón, thêm chính xác 5,0 ml hỗn hợp ACN-H2O tỉ lệ 1:1, chiết siêu âm 10 phút. Lọc qua màng lọc 0,22 µm. Pha loãng 2 lần bằng hỗn hợp ACN-H2O tỉ lệ 1:1, thu được dịch chạy sắc kí.
Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động
Thành phần pha động có ảnh hưởng đến lực tương tác giữa chất phân tích với pha C
Tiến hành khảo sát pha động là đệm phosphat pH = 4,5, chúng tôi nhận thấy có xuất hiện pic ở thời điểm tR = 7,691 phút, trùng với thời gian lưu khi tiêm mẫu chuẩn THP (Hình 3.11). Tuy nhiên, độ tinh khiết pic chỉ đạt 96,8%, điều đó cho thấy có thể có sự hiện diện của nhiều chất khác có cấu trúc hóa học tương tự THP cùng đi ra khỏi cột tại thời điểm này và làm cho pic không tinh khiết. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát thay đổi tỷ lệ pha động để cố gắng tách được THP ra khỏi hỗn hợp một cách triệt để hơn.
Các điều kiện khảo sát tỉ lệ pha động được trình bày trong bảng dưới đây:
STT %ACN % đệm phosphate pH 4,5
1 30 70
2 25 75
3 22 78
Các kết quả sắc kí đồ được thể hiện ở Hình 3.10 (A, B, C)
A
Hình 3.9: Kết quả khảo sát thay đổi tỷ lệ pha động A) Điều kiện 1 B) Điều kiện 2 C) Điều kiện 3
B
C THP
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy: THP rất nhạy với tính phân cực của pha động. Khi giảm tính phân cực của pha động với một tỷ lệ rất nhỏ (từ 25 – 22% ACN), THP đã được tách hẳn ra khỏi hỗn hợp (Rs = 2,7) và có độ tinh khiết pic rất tốt (99,8%). Điều này có thể được giải thích là do cấu trúc của THP có vòng isoquinoline kém phân cực nên khi tăng tính phân cực của pha động, THP sẽ tương tác với pha tĩnh tốt hơn, làm tăng số đĩa lý thuyết từ đó làm tăng hiệu quả tách. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn điều kiện 3 để tiến hành phân tích.
Chúng ta biết rằng các chế phẩm có nguồn gốc dược liệu là một hỗn hợp phức tạp, thành phần gồm rất nhiều chất có độ phân cực và không phân cực khác nhau. Do đó, để tránh hiện tượng cột sắc ký bị nhiễm bẩn bởi các thành phần khác trong dược liệu, sau mỗi lần tách được THP, chúng tôi tăng tỷ lệ ACN lên 40% để tiến hành rửa giải các chất không phân cực còn lưu giữ trong cột. Thời gian phân tích mỗi mẫu chế phẩm là 50 phút với điều kiện gradient cụ thể như sau:
STT Thời gian (phút)
% ACN STT Thời gian (phút)
% CAN
1 0 22 4 45 40
2 27 22 5 45,1 22
3 27,1 40
Khảo sát bước sóng phát hiện.
Thực hiện quét phổ UV từ 200 - 400 nm của pic sắc ký khi tiêm mẫu chuẩn THP 130 ppm, chúng tôi nhận thấy xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 283 nm (hình 3.12). Do đó, chúng tôi lựa chọn tiến hành định lượng THP trong mẫu chế phẩm ở bước sóng 283 nm.
Như vậy, dựa vào chuyên luận riêng của Bình vôi và qua quá trình khảo sát thực nghiệm, chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng THP trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC với các điều kiện cụ thể như sau:
Cột Sunfire C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm)
Pha động: Dung dịch đệm phosphat pH=4,5 - Acetonitril (78:22) Tốc độ dòng: 1,5 ml/min
Thể tích tiêm: 20 µl
Bước sóng phát hiện: 283nm Thời gian phân tích: 50 phút 3.2.2 Thẩm định phương pháp
a. Độ phù hợp hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn THP 65 ppm và ghi lại giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Độ ổn định hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD. Kết