3.2.1.1 Định tính Tetrahydropalmatin
Kết quả sắc kí đồ định tính Tetrahydropalmatin trong chế phẩm được trình bày ở Hình 3.1 (A, B)
Trên bản mỏng khi soi UV, ở các dải khai triển dược liệu Bình vôi, chế phẩm và bán thành phẩm có xuất hiện các vết màu đen nhạt (ở bước sóng 254 nm) và các vết phát huỳnh quang màu xanh lá (ở bước sóng 366 nm) đều có giá trị Rf = 0,89 tương đương với vết xuất hiện trong dải khai triển chất chuẩn THP. Điều đó chứng tỏ trong chế phẩm, cao dược liệu và dược liệu Bình vôi có chứa THP nhưng hàm lượng THP trong chế phẩm và bán thành phẩm khá nhỏ do cường độ màu của vết mờ.
3.2.1.2 Định tính Vitexin
Tiến hành phân tích sắc kí các mẫu theo hệ pha động Dược điển Việt Nam V [4] thu được các kết quả sắc kí đồ như Hình 3.2 (A, B, C).
Hình 3.2: Sắc kí đồ khảo sát hệ pha động định tính Vitexin theo điều kiện DĐVN. A. Soi đèn UV-254 nm. B. Soi đèn UV-366 nm.
C. Phun thuốc thử hiện màu, soi đèn UV-366 nm.
Nhận thấy rằng, ở bước sóng 366 nm vết Vitexin chỉ phát huỳnh quang khi phun thuốc thử, đồng thời trong chế phẩm và cao dược liệu không xuất hiện vết có Rf tương đương với vết xuất hiện trong dải khải triển chất chuẩn và dược liệu Lạc tiên (Rf = 0,76). Chúng tôi cho rằng hàm lượng Vitexin trong chế phẩm quá nhỏ, không đủ để hiện màu hoặc do trong chế phẩm/ bán thành phẩm chứa nhiều loại dược liệu và tạp chất hơn nên hệ pha động tham khảo từ DĐVN không phù hợp để tách Vitexin ra khỏi hỗn hợp nhiều thành phần. Chúng tôi tiến hành thử hệ pha động: ethylacetat - methanol - nước cất - acid formic
Hình 3.3: Sắc kí đồ khảo sát hệ pha động định tính Vitexin theo điều kiện [26]. A. Soi đèn UV-254 nm. B. Soi đèn UV-366 nm.
C. Phun thuốc thử hiện màu, soi đèn UV-366 nm.
Nhận thấy xuất hiện các vết màu đen nhạt (ở bước sóng 254 nm) và các vết phát huỳnh quang màu xanh lá khi phun thuốc thử (ở bước sóng 366 nm) đều có Rf = 0,83 trên các dải khai triển của chuẩn Vitexin, dược liệu Lạc tiên và chế phẩm. Tuy nhiên, màu xanh phát huỳnh quang của vết chế phẩm không hoàn toàn giống với màu của vết chuẩn và vết dược liệu Lạc tiên. Điều đó có thể do trong chế phẩm có Vitexin và các chất có cấu trúc giống Vitexin.
3.2.1.3 Thẩm định phương pháp định tính a. Độ đặc hiệu
Chấm lần lượt 4 dung dịch gồm có Bình vôi, chuẩn THP, chế phẩm và cao dược liệu. Tiến hành chạy sắc kí thu được sắc kí đồ như Hình 3.1 (A, B).
Nhận xét: Trong cả 2 sắc kí đồ thu được khi soi dưới đèn UV-254nm và UV-366 nm đều xuất hiện 3 vết trong 3 dung dịch Bình vôi, chế phẩm, cao dược liệu có cùng giá trị Rf
như trong dung dịch chuẩn THP (Rf = 0,89). Phương pháp có độ chọn lọc tốt. b. Giới hạn phát hiện
Tiến hành chấm thử các dung dịch chuẩn THP lần lượt ở các mức nồng độ 65 ppm; 26 ppm; 13 ppm; 6,5 ppm. Mỗi dung dịch chấm 3 lần thu được kết quả như Hình 3.4 (A). Sau đó, tiến hành pha dung dịch chuẩn THP 13 ppm và dung dịch chuẩn THP 6,5 ppm. Mỗi dung
Hình 3.4: Sắc kí đồ các mẫu chuẩn THP soi ở UV-366 nm. A) Ở các nồng độ khác nhau.
B) Ở nồng độ 13 ppm. C) Ở nồng độ 6,5 ppm.
Nhận xét: Trong bản mỏng A, cả 3 vết ở 3 nồng độ 65 ppm, 26 ppm và 13 ppm đều phát huỳnh quang khi soi dưới đèn UV-366 nm, còn vết ở nồng độ THP 6,5 ppm thì không phát hiện được. Trong bản mỏng B và C, 10 lần thử các vết nồng độ 13 ppm đều dương tính khi soi đèn UV ở bước sóng 366 nm, còn các vết nồng độ 6,5 ppm cả 10 lần thử đều âm tính. Do đó, chúng tôi dự đoán LOD là khoảng 13 ppm.