Sophoricosid là hoạt chất chính trong Hòe giác, có rất nhiều tác dụng sinh học và được dụng như một chất chỉ điểm để kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Hòe giác và các chế phẩm có thành phần Hòe giác [13], [14]. Do đó, chúng tôi lựa chọn sophoricosid làm marker định lượng cho cao đặc Hòe giác và làm pic chính để so sánh trong vân tay sắc ký HPLC định tính cao đặc Hòe giác.
40
a. Phương pháp định lượng sophoricosid trong cao đặc Hòe giác bằng HPLC
Phương pháp HPLC được xây dựng để định lượng sophoricosid trong cao đặc Hòe giác so với các tài liệu tham khảo đã có một số điểm mới đáng chú ý về đối tượng nghiên cứu, cách chuẩn bị mẫu và điều kiện sắc ký như sau:
- Đối tượng: Cao đặc Hòe giác, chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng cho cao đặc Hòe giác bằng HPLC, còn các chuyên luận của DĐTQ 2015 và Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông quy định chỉ tiêu định lượng cho dược liệu Hòe giác.
- Chuẩn đối chiếu: Sử dụng đường chuẩn thay vì điểm chuẩn như phương pháp định lượng sophoricosid trong dược liệu Hòe giác của DĐTQ 2015. Với một đường chuẩn xây dựng sẽ cho phép định lượng nhiều mẫu với nồng độ khác nhau trong khoảng tuyến tính, còn sử dụng điểm chuẩn cần pha dung dịch thử và dung dịch chuẩn có nồng độ gần nhau.
- Dung môi chiết: Sophoricosid từ cao đặc được chiết bằng methanol 50% thay vì chiết bằng ethanol 70% như DĐTQ 2015 và Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông. Theo kết quả khảo sát, dung môi chiết methanol 50% có ưu điểm là khả năng hòa tan sophoricosid từ cao đặc tốt hơn ethanol 70%.
- Thời gian chiết: 30 phút theo Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông, thời gian đã giảm xuống so với DĐTQ 2015 (45 phút) giúp giảm thời gian chuẩn bị mẫu thử. - Thời gian sắc ký: Việc lựa chọn pha động theo DĐTQ 2015 thay vì chương trình pha động như Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông đã giúp chúng tôi có thể điều chỉnh thời gian sắc ký dễ dàng hơn. Lựa chọn thời gian 20 phút cho một mẫu khiến thời gian sắc ký còn 1/3 so với thời gian 60 phút của chương trình pha động theo Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông, từ đó giúp giảm thời gian định lượng một mẫu, tiết kiệm cả dung môi lẫn thời gian.
- Nhận diện pic SOP: Trong chuyên luận dược liệu Hòe giác của DĐTQ 2015, việc nhận diện pic SOP là nhờ việc có pic trên sắc ký đồ tương ứng về thời gian lưu so với pic chính của sắc ký đồ chuẩn, tuy nhiên chuyên luận không quy định giới hạn cho sự khác biệt về thời gian lưu này. Tham khảo Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông, chúng tôi đã bổ sung tiêu chuẩn ≤ 5,0% so với sắc ký đồ chuẩn để tăng tính khách quan trong việc kết luận có hay không sự xuất hiện của sophoricosid trong mẫu thử.
41
b. Phương pháp định tính cao đặc Hòe giác bằng HPLC
Phương pháp HPLC được xây dựng để định tính cao đặc Hòe giác có một số điểm mới đáng chú ý so với các tài liệu tham khảo. Ngoài sự thay đổi về dung môi chiết, thời gian chiết, thời gian sắc ký giúp tối ưu hóa kết quả, tiết kiệm tài nguyên và thời gian đã được bàn luận trong phần định lượng ở trên, phương pháp định tính của chúng tôi còn có một số điểm mới như sau:
- Đối tượng: Cao đặc Hòe giác, chúng tôi xây dựng phương pháp định tính cho cao đặc Hòe giác bằng HPLC, còn các chuyên luận của DĐTQ 2015 và Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông quy định chỉ tiêu định tính cho dược liệu Hòe giác.
- Nhận diện pic SOP: Chuyên luận dược liệu Hòe giác của DĐTQ 2015 định tính dược liệu nhờ việc có pic trên sắc ký đồ tương ứng về thời gian lưu so với pic chính của sắc ký đồ chuẩn, tuy nhiên không có quy định giới hạn cho sự khác biệt về thời gian lưu này. Tham khảo Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông, chúng tôi đã bổ sung tiêu chuẩn ≤ 2,0% so với sắc ký đồ chuẩn để tăng tính khách quan trong việc kết luận có hay không sự xuất hiện của sophoricosid trong mẫu thử.
- Xây dựng vân tay sắc ký HPLC: Sau khi xác định pic SOP trên sắc ký đồ nhờ so sánh thời gian lưu với pic SOP trên sắc ký đồ chất chuẩn, chúng tôi đã xác định một số pic đặc trưng xuất hiện trong sắc ký đồ cao đặc và tính thời gian lưu tương đối của chúng so với SOP. Đây là điểm khác biệt chính của chúng tôi so với phương pháp định tính bằng HPLC được sử dụng trong DĐTQ 2015, khi tài liệu này chỉ so sánh thời gian lưu và kết luận sự có mặt của SOP, chúng tôi xây dựng vân tay sắc ký nhờ thời gian lưu tương đối giúp phương pháp định tính có tính chọn lọc cao hơn.
- Số pic trên vân tay sắc ký: So với Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông, chúng tôi chọn 8 pic đặc trưng trên sắc ký đồ cao đặc Hòe giác, thay vì 5 pic trên sắc ký đồ dược liệu, chúng đều có thời gian lưu tương đối tương ứng với sắc ký đồ dược liệu chuẩn và dược liệu nguyên liệu.
Các điểm khác biệt trong phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hòe giác bằng HPLC của chúng tôi so với các tài liệu tham khảo được tóm tắt trong Bảng 3.12 dưới đây:
42
Bảng 3.12. Một số điểm mới trong phương pháp ĐT, ĐL cao đặc Hòe giác bằng
HPLC
STT Các đặc điểm so sánh Phương pháp(*) TLTK (1) TLTK (2)
1 Đối tượng Cao đặc Hòe giác
Dược liệu Hòe giác
Dược liệu Hòe giác 2 Dung môi chiết Methanol 50% Ethanol 70% Ethanol 70% 3 Chuẩn đối chiếu Đườn chuẩn
6 điểm Điểm chuẩn
Đường chuẩn 5 điểm 4 Thời gian chiết 30 phút 45 phút 30 phút
5 Pha động MeOH – ACN – H3PO4 0,07% (12 : 20 : 68) MeOH – ACN – H3PO4 0,07% (12 : 20 : 68) MeOH – ACN – HCOOH 0,4% (Chương trình pha động) 6 Thời gian sắc ký 20 phút - 60 phút 7 Nhận diện pic SOP ĐT ≤ 2,0% (a) - ≤ 2,0% (a) ĐL ≤ 5,0% (a) - ≤ 5,0% (a)
8 Vân tay sắc ký Có Không Có
9 Số pic trên vân tay
sắc ký 8 pic - 5 pic
Chú thích:
(*) Phương pháp ĐT, ĐL cao đặc Hòe giác bằng HPLC được xây dựng.
TLTK (1) Dược điển Trung Quốc 2015, chuyên luận Hòe giác.
TLTK (2) Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông, chuyên luận Hòe giác.
- Không có thông tin
(a) Chênh lệch RT so với RT pic SOP của SKĐ mẫu chuẩn
Tóm lại, trên cơ sở tham khảo DĐTQ 2015 và các tài liệu khác, phương pháp định tính, định lượng sophoricosid trong cao đặc Hòe giác bằng HPLC của chúng tôi được xây dựng, có điều kiện sắc ký phù hợp với trang thiết bị có sẵn của phòng thí nghiệm. Phương pháp đã được thẩm định theo hướng dẫn của ICH, AOAC [11], [19] về tính
43
thích hợp hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng. Phương pháp HPLC có độ đặc hiệu cao đã được chứng minh bởi kết quả thẩm định dựa trên 2 tiêu chí: Thời gian lưu của pic sophoricosid trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn có sự tương đồng, hệ số chồng phổ UV của pic sophoricosid thử và chuẩn. Phương pháp HPLC đã xây dựng có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic trong khoảng nồng độ khảo sát, đồng thời độ lặp lại, độ đúng cao của phương pháp đã khẳng định phương pháp HPLC cho kết quả đáng tin cậy.