❖ Khảo sát độ hấp thụ cực đại
Chuẩn bị mẫu trắng: Hút 1ml MeOH vào bình định mức 10ml. Thêm 2,5ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%, lắc để trong 5 phút. Sau đó thêm 4ml dung dịch Na2CO3 7,5%, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Để yên trong 60 phút.
Hút 1ml chuẩn 60 µg/ml vào bình định mức 10ml, thêm 2,5ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%, lắc để phản ứng 5 phút. Sau đó thêm 4ml dung dịch Na2CO3 7,5%, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Để phản ứng xảy ra trong 60 phút ở nhiệt độ phòng, quét phổ để xác định bước sóng cực đại.
18
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác 2,5mg chuẩn acid gallic hòa tan bằng vào bình định mức 25ml, thêm vừa đủ đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml. Lần lượt hút 2ml, 4ml, 6ml, 8ml vào bình định mức 10ml, định mức bằng MeOH thu được dãy chuẩn có nồng độ 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml.
Hút 1ml dung dịch chuẩn các nồng độ vào bình định mức 10ml, thêm 2,5ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%, lắc để phản ứng 5 phút. Sau đó thêm 4ml dung dịch Na2CO3 7,5%, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Để phản ứng xảy ra trong 60 phút ở nhiệt độ phòng. Mẫu trắng được chuẩn bị song song. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 754,5 nm, yêu cầu hệ số xác định R2 ≥ 0,99 [13].
❖ Thẩm định phương pháp phân tích
• Tính thích hợp hệ thống
Tiến hành đo 6 lần một mẫu dung dịch chuẩn nồng độ 0,06 mg/ml, trong cùng điều kiện đo quang, ghi lại độ hấp thụ của các mẫu ở các lần đo.
Yêu cầu: RSD của độ hấp thụ các lần đo không vượt quá 2% [13]. • Độ lặp lại của phương pháp chiết
Chuẩn bị 6 mẫu dịch thử của cùng một mẫu dược liệu Xấu hổ Pleiku theo quy trình đã xây dựng. Đo quang 6 mẫu dịch thử trên trong cùng điều kiện, ghi lại độ hấp thụ của các mẫu.
Yêu cầu: RSD hàm lượng polyphenol toàn phần giữa các mẫu không vượt quá 11% [13].
• Độ đúng
Phương pháp thêm chuẩn: Thêm chuẩn acid gallic vào dược liệu rồi tiến hành chiết xuất. Tạo các mẫu thử thêm chuẩn có nồng độ tương ứng là 80%, 100%, 120% lượng polyphenol toàn phần có trong mẫu thử, kí hiệu lần lượt là T1, T2, T3. Tạo 3 mẫu thử thêm chuẩn với mỗi nồng độ thêm chuẩn.
Tính tỷ lệ thu hồi R% của mỗi lượng chất chuẩn thêm vào các mẫu thêm chuẩn theo công thức:
19
R% = 𝑚t+c− mt
mc x 100
Trong đó:
mt+c: lượng acid gallic trong dung dịch thử thêm chuẩn (µg) mt: lượng acid gallic trong dung dịch thử (µg)
mc: lượng acid gallic trong dung dịch chuẩn thêm vào (lý thuyết) Yêu cầu: Độ thu hồi trung bình nằm trong khoảng 95% - 105% [13].
❖ Chuẩn bị dung dịch dung dịch thử
Cân chính xác 1g bột dược liệu. Thêm 10ml MeOH, siêu âm 15 phút. Lọc qua giấy lọc. Hút 1ml dịch lọc vào bình định mức 10ml, thêm đến vạch bằng MeOH thu được dung dịch thử. Tiến hành 3 lần.
❖ Tiến hành định lượng
Hút 1ml dung dịch thử vào bình định mức 10ml, thêm 2,5ml thuốc thử Folin- Ciocalteu 10%, lắc để phản ứng 5 phút. Sau đó thêm 4ml dung dịch Na2CO3 7,5%, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Để phản ứng xảy ra trong 60 phút ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 754,5 nm. Làm lặp lại 3 lần với mỗi mẫu. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu dược liệu được xác định quy về đương lượng acid galic theo công thức:
𝑋 = 𝐶 ×𝑉×𝐾×10−3
𝑚𝑑𝑙 ×(100−𝑎)× 10−2 (mg GAE/g dược liệu)
Trong đó:
X: Hàm lượng polyphenol toàn phần của mẫu thử (mg GAE/g dược liệu) C: Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử (µg/ml)
V: Thể tích dung dịch chiết gốc K: Hệ số pha loãng (100)
mdl : Khối lượng dược liệu (g) a: Độ ẩm dược liệu (%)
20
Từ kết quả nghiên cứu dự kiến chỉ tiêu định lượng polyphenol toàn phần dược liệu Xấu hổ.