Tiến hành theo Dược điển Việt Nam V, phụ lục 12.10 [4].
Cân chính xác 4,000 g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào trong bình nón 250ml. Thêm chính xác 100,0 ml nước, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6 giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô. Lấy chính xác 20 ml dịch lọc cho vào một cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105°C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính phần trăm lượng chất chiết được bằng nước theo dược liệu khô. Làm với 5 mẫu, mỗi mẫu làm 3 lần. Hàm lượng chất chiết được trong nước được tính theo công thức:
% Chất chiết được trong nước = 𝑚𝑐ắ𝑛 × 100
21
Trong đó:
mcắn: Khối lượng cắn sau khi sấy (g) mdl: Khối lượng dược liệu (g)
a: Hàm ẩm dược liệu (%)
Từ kết quả nghiên cứu dự kiến chỉ tiêu hàm lượng chất chiết được trong nước của dược liệu Xấu hổ.
22
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Định tính dược liệu Xấu hổ bằng phản ứng hóa học
Tiến hành như mục 2.3.1, kết quả định tính các mẫu dược liệu Xấu hổ bằng phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất có trong các mẫu dược liệu Xấu hổ bằng phản ứng hóa học
Nhóm
chất Tên phản ứng TH PK ĐL HN TB
Flavonoid
Phản ứng với dd kiềm loãng ++ ++ ++ ++ ++
Phản ứng với hơi amoniac + + + + +
Phản ứng Cyanidin + + + + + Phản ứng với dd FeCl3 5% ++ ++ ++ ++ ++ Alcaloid TT Mayer + + + + + TT Dragendorff ++ ++ ++ ++ ++ TT Bouchardat + + + + + Sterol Phản ứng Liebermann ++ ++ ++ ++ ++ Coumarin Phản ứng mở vòng lacton - - - - -
Quan sát huỳnh quang dưới
ánh sáng tử ngoại - - - - -
23
Nhận xét:
Từ kết quả định tính có thể nhận thấy cả 5 mẫu đều có mặt các nhóm chất flavonoid, alcaloid và sterol; không có mặt coumarin. Đặc biệt phản ứng với dung dịch kiềm loãng và phản ứng với dung dịch FeCl3 5% cho kết quả dương tính rõ nhất chứng tỏ sự có mặt của các hợp chất phenol là thành phần chính trong dược liệu. Do đó, đề xuất chỉ tiêu định tính dược liệu Xấu hổ bằng phản ứng hóa học bao gồm các phản ứng với dung dịch NaOH 10%, phản ứng với dung dịch FeCl3 5% và phản ứng Cyanidin.. Phản ứng coumarin âm tính được xem là phản ứng phân biệt loài Mimosa pudica L. với loài Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa. dễ nhầm lẫn khi thu hái.
3.2. Định tính dược liệu Xấu hổ bằng sắc ký lớp mỏng
Tiến hành như mục 2.3.2, kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng 5 mẫu Xấu hổ được trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết dược liệu Xấu hổ
Ký hiệu:
A. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ=254 nm
24
B. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ=366 nm
C. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ=366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG
Nhận xét:
Dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và 366 nm hầu như không quan sát rõ các vết chất trong cả 5 mẫu. Thuốc thử NP/PEG là thuốc thử đặc trưng cho nhóm chất flavonoid nên được lựa chọn để hiện màu các vết. Thuốc thử NP/PEG sau khi phun làm tăng huỳnh quang các vết dưới UV 366 nm, nhận thấy hình ảnh sắc ký đồ 5 mẫu dược liệu Xấu hổ là khá tương đồng,. Hình ảnh sắc ký đồ cũng sơ bộ cho thấy sự khác biệt về hàm lượng của các thành phần trong từng mẫu. Sắc ký đồ mẫu Pleiku xuất hiện thêm 1 vết huỳnh quang vàng ở vị trí Rf = 0,74. Cả 7 vùng huỳnh quang vàng tương đồng ở các mẫu Thái Bình, Đà Lạt, Mỹ Đức, Pleiku đều khá đậm. Trong khi đó, mẫu Thanh Hóa có cả 7 vùng nhưng màu sắc tương đối nhạt.
Do đó, đề xuất chỉ tiêu định tính dược liệu Xấu hổ bằng sắc ký lớp mỏng: Hình ảnh sắc ký đồ của các flavonoid trong dược liệu Xấu hổ đặc trưng bởi sự có mặt của 7 vùng được mô tả ở hình 3.2.
25
Phần phía trên bản mỏng Vùng huỳnh quang vàng (Rf = 0,73)
Vùng huỳnh quang cam (Rf = 0,46) Vùng huỳnh quang vàng (Rf = 0,35)
Vùng huỳnh quang vàng (Rf = 0,25) Vùng huỳnh quang cam (Rf = 0,23) Vùng huỳnh quang vàng (Rf = 0,15)
Vùng huỳnh quang vàng (Rf = 0,04) Mẫu thử
Hình 3.2. Mô tả sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dược liệu Xấu hổ sau khi hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG