Năm 2014 Dương Văn Tăng và cộng sự thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng sử dụng mã vạch COI trong việc định loại động vật tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam”, tiến hành với ba mẫu có tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam ký hiệu GN.bttnvn, GC.bttnvn, BHM.bttnvn được giám định hình thái ban đầu và có tên là Gấu ngựa (Ursus thibetanus), Gấu chó (Helarctos malayanus hoặc tên đồng nghĩa: Ursus malayanus) và Báo hoa mai (Panthera pardus) được sử dụng cho phân tích này. Kết quả đã khuyếch đại được vùng gen COI ở Gấu chó, Gấu ngựa có cùng kích thước 623 bp còn ở Báo hoa mai là 653 bp. Phân tích bằng phần mềm máy tính Mega 5.2.2 và chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy các mẫu vật Gấu ngựa, Gấu chó, Báo hoa mai có tên chính xác như đã xác định loài bằng hình thái. Kết quả mẫu nghiên cứu GN.bttnvn, GC.bttnvn, BHM.bttnvn đã đăng ký thành công vơi Genbank với các mã số công bố KF986481, KF986482 và KF986483. Mức độ tương đồng của các trình tự từ các mẫu nghiên cứu Gấu ngựa, Gấu chó và Báo hoa mai so với dữ liệu công bố trên GenBank lần lượt là 99%, 99,5% và 99,85%. Với kết quả thu được như trên, vùng gen COI có thể được sử dụng để giám định các mẫu động vật quý hiếm không nguyên vẹn [1].
Năm 2014, Dương Thúy Yên thuộc Đại học Cần Thơ tiến hành nghiên cứu “So sánh trình tự một số gen mã vạch của cá rô đầu vuông và cá rô đồng tự nhiên” thu ở xã Vĩnh Thuận Tây, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang, nơi phát hiện cá rô đầu vuông với mẫu cá rô tự nhiên được thu ở 3 nơi, gồm Rừng U Minh Hạ - Cà Mau, vườn quốc gia Tràm Chim, Tam Nông – Đồng Tháp và Châu Thành A – Hậu Giang. Số mẫu thu của mỗi dòng cá là 40 mẫu. Nghiên cứu này nhằm kiểm tra giả thuyết trên dựa vào sự so sánh trình tự 3 gen mã vạch trong ty thể (gen Cytochrom C oxidase subunit 1- COI và Cytochorome
18
b-Cyt b) và trong nhân (Gen Rhodopsin – Rho) giữa cá rô đầu vuông và cá rô tự nhiên thu ở 3 tỉnh. Kết quả tìm thấy 3 dạng trình tự của gen COI (trong 15 mẫu), 3 dạng của gen Cyt b (21 mẫu) và 1 dạng gen Rho (7 mẫu) trong các mẫu nghiên cứu. So sánh trình tự gen COI và Cyt b của cá rô trong nghiên cứu này tương đồng trên 99% với cá rô Anabas testudineus có sẵn ở cơ sở dữ liệu của GenBank và hệ thống BOLD [5].
Năm 2015, Nguyễn Phương Thảo và Dương Thúy Yên tiến hành nghiên cứu đề tài “So sánh đặc điểm hình thái và DNA mã vạch của hai loài cá bống trân Butis butis và Butis humeralis”. Đề tài so sánh đặc điểm hình thái và trình tự gen cytochrome C oxidase subutnit I (COI) của hai “loài” cá bống trân Butis butis và Butis humeralis đã được công bố trong các nghiên cứu trước để kiểm chứng việc định danh hai loài. Kết quả về hình thái, chúng giống nhau ở hình dạng thân, mõm, màu sắc và cấu tạo cơ gốc vi ngực và một số chỉ tiêu đo. Tuy nhiên, chúng khác nhau ở vạch và màu sắc của mắt, vị trí bắt đầu của vi lưng và vi hậu môn, tỉ lệ dài đầu/khoảng cách hai mắt và cao thân/cao cuống đuôi. Về trình tự gen COI, các mẫu của hai loài giống nhau ở mức 99-100%. Khoảng cách di truyền giữa 2 loài (0,003±0,001) tương đương với khoảng cách di truyền trong cùng một loài. Như vậy, 2 nhóm cá bống trân là cùng một loài. Loài này khác với loài B. butis ở Genbank (giống trình tự gen COI ở mức 86%), chứng tỏ việc phân loại loài của cá B. butis trên thế giới chưa rõ ràng và cần tiếp tục được nghiên cứu [4].
Năm 2015, Trần Thị Việt Thanh và cộng sự đã tiến hành đề tài “Sử dụng mã vạch DNA (DNAbarcodes) trong việc xác định mẫu chim tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam”. Đề tài thực hiện giám định tên loài cho 4 mẫu chim thuộc họ Khướu (Timaliidae): 005_BTTNVN (Khướu mào cổ trắng), 028_BTTNVN (Lách tách đầu đốm), 045_BTTNVN (Lách tách mày trắng) và 055_BTTNVN (Khướu mặt đên). DNA được tách từ mẫu máu, sau đó tiến
19
hành phản ứng PCR, tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự vùng gen Barcode (COI) với kích thước khoảng 650bp cho mỗi mẫu. Kết quả giải trình tự cho thấy mước độ tương đồng di truyền cao, 99,7% (028_ BTTNVN/Alcippe castaneceps), 99,8% (045_BTTNVN/ Alcippe vinipectus), 99,28% (99,2-99,5%; 055_BTTNVN/ Garrulax affinis) và mẫu 005_BTTNVN thuộc giống Ynhina, được xác định tên loài Y. diademata trên GenBank. Các thông tin di truyền thu được trên mỗi mẫu đều tương đồng với phân loại bằng hình thái. Bốn trình tự trên đã được đăng ký trên GenBank với mã số là: KP768404, KP768406, KP708406, KP768407 [6].
20
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Một số giống vật nuôi phổ biến ở Việt Nam như bò, lợn, dê được thu thập mẫu phục vụ cho nghiên cứu. Mẫu mô tai bò, lợn, dê được thu nhận trên địa bàn các huyện Sơn Dương - Tuyên Quang, huyện Đại Từ - Thái Nguyên, huyện Tam Điệp – Ninh Bình và huyện Lương Sơn – Hòa Bình.
Các mẫu mô được thu nhận trong thời gian ngắn, cất giữ trong dung dịch bảo quản thích hợp và vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm. DNA của từng mẫu được thu nhận độc lập, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.1: Các mẫu thí nghiệm phục vụ quá trình nghiên cứu
STT Tên mẫu Địa chỉ thu mẫu Ký hiệu
1 Tai bò Phúc Ứng - Sơn Dương - Tuyên Quang B 2 Tai lợn Ký Phú - Đại Từ - Thái Nguyên L 3 Tai dê Hoa Lư –Tam Điệp – Ninh Binh DN1 4 Tai dê Hoa Lư –Tam Điệp – Ninh Binh DN2 5 Tai dê Cao Dương –Lương Sơn –Hòa Bình DH1 6 Tai dê Cao Dương –Lương Sơn –Hòa Bình DH2
Mồi thực hiện phản ứng khuếch đại đoạn gen COI được cung cấp bởi viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Thông tin của các cặp mồi được liệt kê trong bảng 3.2.
21 Bảng 3.2. Trình tự mồi cho phản ứng PCR Stt Mồi Mẫu Trình tự mồi (5’->3’) Ta (oC) Kích thước (bp)
1 CF1d CR1d Dê TTC TCA ACC AAC CAC AAR GAY ATY GG TAG ACT TCT GGG TGG CCR AAR AAY CA 51 750 2 CF1l CR1l Lợn CAT TGG AGT AGT CCT ACT GTG CAG GAA TAG GAG ATG 56 250 3 CF1b CR1b Bò AAT GAT ATT TGT CCT CA ACA GGC CTA TTC CAT GCA 56 250
Ghi chú: Y là nucleotide T hoặc C, R là nucleotide G hoặc A
3.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
3.2.1. Thiết bị nghiên cứu
Bảng 3.3. Danh mục các thiết bịđược sử dụng
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
1 Bộđiện di Scie – plas Ltd – UK 2 Bểổ nhiệt Techne – OSI
3 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany
4 Máy cất nước Canada Bio Water system – Pall Co.UK 5 Máy chụp gel Gel Logic 1500 – Kodal – USD
6 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba – Japan 7 Máy ly tâm Eppen dorf –CHLB Đức
8 Máy PCR Amplied Biosystems USD/Singapore 9 Máy spindown E-centrifuge – Wealtex – TaiWan/USA 10 Máy vortex Vortex Genius 3 – IKA Genmany/China 11 Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan
12 Tủ an toàn sinh học cấp2 Nu – 425 – 400E – Nuaire – USA
13 Tủ lạnh40C, -200C Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy 14 Máy đo quang phổ kế
22
3.2.2. Hóa chất
Các hóa chất chuyên dụng sử dụng cho phân tích sinh học phân tử được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.4. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất
1 Tris HCl Merck
2 EDTA Merck
3 2-mercaptoethanol Merck
4 Protein K Thermo scientific
5 Rnase Thermo scientific
6 Chloroform Merck
7 Isoamin alcohol Merck
8 Tris Base Merck
9 Acid Acetic Merck
10 Loading Dye Merck
11 Agarose Bio neer
12 Ethidium Bromide Merck
13 Ba cặp mồi nhân gen COI Thermo scientific
14 Master Mix Thermo scientific
15 H20 Thermo scientific
16 Isopropanol Merck
17 Elution Buffer Merck
18 Ethanol Merck
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Bộ môn sinh học phân tử và Công nghệ gen – Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên – Tổ 10 – Xã Quyết Thắng – TP Thái Nguyên.
23
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ ngày 01/01/2019 đến ngày 30/05/2019.
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA genome của bò, lợn, dê.
- Nhân gen COI của một số vật nuôi: bò, lợn, dê. - Giải trình tự gen COI.
- So sánh, đánh giá DNA barcode của bò với cơ sở dữ liệu. - So sánh, đánh giá DNA barcode của lợn với cơ sở dữ liệu. - So sánh, đánh giá DNA barcode của dê với cơ sở dữ liệu.
- Đánh giá DNA barcode đặc hiệu giữa các loài trong nghiên cứu.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
Phương pháp lấy mẫu mô tai được tiến hành như sau: Dùng kìm chuyên dụng lấy một mẩu mô tai đưa vào ống eppendorf chứa cồn 70% bảo quản lạnh ở 40C trong khoảng 24h. Sau đó dùng nước rửa sạch, thấm khô trên giấy thấm rồi đưa vào ống eppendorf chứa cồn 70% khác đembảo quản lạnh ở -200C cho đến khi sử dụng.
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tai được tiến hành theo các bước sau.
Bước 1: Dùng kẹp lấy mẫu ra và thấm khô cồn, sử dụng dao loại bỏ sạch lông cùng các chất bẩn màu đen bám trên mẫu sau đó nghiền nhỏ mẫu.
Bước 2: Cho phần mẫu đã nghiền nhỏ vào ống eppendorf 1,5 ml, bổ sung thêm 500µl buffer lysis. Sau đó cho vào máy vortex, rung trong khoảng 15 giây và ủở 500C trong 1 giờ(15 phút đảo trộn một lần).
24
Bước 4: Thêm 5 µl Rnase vào ống eppendorf , ủở 370C trong 1 giờ. Bước 5: Bổ sung thêm 500 µl CIAA, lắc đều nhẹ bằng tay cho đến khi thấy dung dịch có màu trắng sữa đồng nhất, ủở -200C trong 1 giờ.
Bước 6: Ly tâm 12000 rpm trong 15 phút, dùng pipette hút và chuyển pha trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới (khoảng 400 µl).
Bước 7: Bổ sung thêm isopropanol với tỉ lệ 2:1 với mẫu. Sau khi đảo trộn đều thì ủở - 200C trong 2 giờ.
Bước 8: Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu căn DNA.
Bước 9: Bổ sung 500µl cồn 70% vào ống eppendorf . Ly tâm 8000rpm trong 5 phút.
Bước 10: Đổ hết cồn, “spindow” rồi dùng pipette hút hết cồn dư. Sau đó để khô tựnhiên đến khi cặn DNA trong suốt.
Bước 11: Thêm 50 µl dung dịch đệm Elution Buffer. Bảo quản trong tủ -200C.
3.5.3. Phương pháp PCR
DNA tổng số được tách chiết sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại chỉ thịCOI. Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR Hóa chất Thể tích (µl) Master mix 5 Primer F 0,4 Primer R 0,4 H2O 3,2 DNA khuôn 1 Tổng thể tích 10
25
Trộn đều các thành phần sau đó đặt vào máy PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện như sau:
Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen COIở dê:
Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen COIở gà, lợn, bò, chó:
3.5.4. Phương pháp xác định trình tự các nucleotide
Các sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại sẽ được giải trình tự ở công ty VNDAT tại Malaysia.
3.5.5. Phân tích dữ liệu
Trình tự chỉ thị COI của các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự được so sánh với trình tự các chỉ thị COI đã được công bố trên thư viện mã vạch BOLD và NCBI thông qua phần mềm vecter NTI phiên bản 11.5, phần mềm MEGA 7.0, DNAstar 5.0 và BioEdit.
26
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả tách DNA tổng số
Sản phẩm DNA sau khi tách chiết từ các mẫu mô tai và mẫu máu được điện di kiểm tra trên gel agrarose 1%. Kết quả tách chiết DNA tổng số các mẫu mô tai được thể hiện trong hình 4.1.
1 2 3 4 5 6
Hình 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số mẫu mô tai
(Đường chạy số1 đến số 6 lần lượt là các mẫu L(lợn), B(bò), DH1(dê), DH2(dê), DN1(dê), DN2(dê)
Từ kết quả trên có thể thấy, sản phẩm DNA tổng sốthu được tương đối đồng đều các băng sáng rõ nét, ít bịđứt gẫy. DNA tổng sốđược tiến hành xác định độ tinh sạch và hàm lượng DNA bằng máy đo quang phổ kế. kết quả được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quảđo độ tinh sạch DNA
Mẫu L B DH1 DH2 DH3 DH4
27
Từ kết quả trên cho thấy tỉ số OD260/OD280 ở các mẫu nghiên cứu tương đối đồng đều. Kết quả dao động nằm trong khoảng 1,8 đến 2 cho thấy các mẫu DNA tổng số không lẫn tạp nhiều protein hay RNA.
Dựa vào kết quả điện di hình 4.1 và kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA ở bảng 4.1 cho thấy các mẫu DNA thu được hoàn toàn đủđiều kiện cho phản ứng PCR và các nghiên cứu tiếp theo.
4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thịCOI
Hình 4.2a. Kết quả PCR chỉ thị COI
của các mẫu DH1, DH2,DN1, DN2
(Giếng L: Lader GeneRuler 1kb, đường
chạy từ1 đến 4 lần lượt là các mẫu DH1,
DH2 , DN1, DN2)
Hình 4.2b. Kết quả PCR chỉ thị COI của
các mẫu B, L
(Giếng L: Lader GeneRuler 1kb, đường
chạy từ1 đến 2 lần lượt là các mẫu B, L)
Sản phẩm khuếch đại chỉ thị COI được thể hiện trên hình 4.2a và hình 4.2b. Từ kết quả trên cho thấy các chỉ thị đều được khuếch đại thành công. Sản phẩm PCR chỉ cho một băng sáng duy nhất, không xuất hiện sản phẩm phụ. Đối chiếu với DNA chuẩn của hãng Thermo Scientific, kích thước sản phẩm khuếch đại chỉ thị COI đều có kích thước đúng như dự kiến ~750bp và 250bp. Như vậy, sản phẩm PCR đủ điều kiện để có thể giải trình tự.
28
4.3. Kết quả phân tích các chỉ thị DNA bacoding
Các sản phẩm PCR đủ tiêu chuẩn được gửi tới công ty VNDAT tại Malaysia, tại đây các sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi giải trình tự. Trình tự được xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger.
4.3.1. Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự
Chất lượng của kết quả giải trình tự được xác định bằng chỉ số QV (Quality Value) dựa trên phần mềm Seqscanner v1.0 và được chia theo ba cấp độ: Chất lượng thấp, QV nằm trong khoảng từ 0 – 19 (biểu thị màu đỏ); chất lượng trung bình, QV nằm trong khoảng 20 – 30 (biểu thị màu vàng) và chất lượng cao, tương ứng với giá trị QV lớn hơn 30 (biểu thị bàng màu xanh lam) [23]. Giá trị của QV phụ thuộc vào cường độ tín hiệu giải trình tự. Chất lượng các mẫu giải trình tự như sau:
DH1
DH2
29 DN1 DN2 L B
Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu theo giái trị QV
Qua kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự thể hiện trên hình 4.3 cho thấy đoạn 20 -25 bp đầu tiên và 20 -25 bp cuối (màu đỏ, vàng) của chỉ thị chất lượng thấp, phần màu xanh cho chất lượng tín hiệu giải trình tự cao. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết giải trình tự, do đoạn đầu và cuối phản ứng giải trình tự không ổn định dẫn tới tín hiệu thấp, khi phản ưng ổn định cường độ tín hiệu cao và chính xác.
30
4.4. Kết quả so sánh, phân tích chỉ thịCOI các mẫu nghiên cứu
4.4.1. Chỉ thị COI của mẫu dê
4.4.1.1. Kết quả so sánh, phân tích cùng loài
Để khẳng định chỉ thị COI đã được khuếch đại là chỉ thị COI của loài
Capra hircus (dê). Chúng tôi tiến hành BLAST trình tự COI của 4 mẫu dê nghiên cứu trên (NCBI). Kết quả được thể hiện đại diện trên hình 4.4.
Hình 4.4: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Capra
hircus đã công bố trên NCBI
Kết quả BLAST cho thấy chỉ thị COI của 4 mẫu dê nghiên cứu có sự tương đồng cao là 99% so với các chỉ thị của loài Capra hircus đã được công