Trình tự chỉ thị COI của các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự được so sánh với trình tự các chỉ thị COI đã được công bố trên thư viện mã vạch BOLD và NCBI thông qua phần mềm vecter NTI phiên bản 11.5, phần mềm MEGA 7.0, DNAstar 5.0 và BioEdit.
26
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả tách DNA tổng số
Sản phẩm DNA sau khi tách chiết từ các mẫu mô tai và mẫu máu được điện di kiểm tra trên gel agrarose 1%. Kết quả tách chiết DNA tổng số các mẫu mô tai được thể hiện trong hình 4.1.
1 2 3 4 5 6
Hình 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số mẫu mô tai
(Đường chạy số1 đến số 6 lần lượt là các mẫu L(lợn), B(bò), DH1(dê), DH2(dê), DN1(dê), DN2(dê)
Từ kết quả trên có thể thấy, sản phẩm DNA tổng sốthu được tương đối đồng đều các băng sáng rõ nét, ít bịđứt gẫy. DNA tổng sốđược tiến hành xác định độ tinh sạch và hàm lượng DNA bằng máy đo quang phổ kế. kết quả được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Kết quảđo độ tinh sạch DNA
Mẫu L B DH1 DH2 DH3 DH4
27
Từ kết quả trên cho thấy tỉ số OD260/OD280 ở các mẫu nghiên cứu tương đối đồng đều. Kết quả dao động nằm trong khoảng 1,8 đến 2 cho thấy các mẫu DNA tổng số không lẫn tạp nhiều protein hay RNA.
Dựa vào kết quả điện di hình 4.1 và kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA ở bảng 4.1 cho thấy các mẫu DNA thu được hoàn toàn đủđiều kiện cho phản ứng PCR và các nghiên cứu tiếp theo.
4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thịCOI
Hình 4.2a. Kết quả PCR chỉ thị COI
của các mẫu DH1, DH2,DN1, DN2
(Giếng L: Lader GeneRuler 1kb, đường
chạy từ1 đến 4 lần lượt là các mẫu DH1,
DH2 , DN1, DN2)
Hình 4.2b. Kết quả PCR chỉ thị COI của
các mẫu B, L
(Giếng L: Lader GeneRuler 1kb, đường
chạy từ1 đến 2 lần lượt là các mẫu B, L)
Sản phẩm khuếch đại chỉ thị COI được thể hiện trên hình 4.2a và hình 4.2b. Từ kết quả trên cho thấy các chỉ thị đều được khuếch đại thành công. Sản phẩm PCR chỉ cho một băng sáng duy nhất, không xuất hiện sản phẩm phụ. Đối chiếu với DNA chuẩn của hãng Thermo Scientific, kích thước sản phẩm khuếch đại chỉ thị COI đều có kích thước đúng như dự kiến ~750bp và 250bp. Như vậy, sản phẩm PCR đủ điều kiện để có thể giải trình tự.
28
4.3. Kết quả phân tích các chỉ thị DNA bacoding
Các sản phẩm PCR đủ tiêu chuẩn được gửi tới công ty VNDAT tại Malaysia, tại đây các sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi giải trình tự. Trình tự được xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger.
4.3.1. Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự
Chất lượng của kết quả giải trình tự được xác định bằng chỉ số QV (Quality Value) dựa trên phần mềm Seqscanner v1.0 và được chia theo ba cấp độ: Chất lượng thấp, QV nằm trong khoảng từ 0 – 19 (biểu thị màu đỏ); chất lượng trung bình, QV nằm trong khoảng 20 – 30 (biểu thị màu vàng) và chất lượng cao, tương ứng với giá trị QV lớn hơn 30 (biểu thị bàng màu xanh lam) [23]. Giá trị của QV phụ thuộc vào cường độ tín hiệu giải trình tự. Chất lượng các mẫu giải trình tự như sau:
DH1
DH2
29 DN1 DN2 L B
Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu theo giái trị QV
Qua kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự thể hiện trên hình 4.3 cho thấy đoạn 20 -25 bp đầu tiên và 20 -25 bp cuối (màu đỏ, vàng) của chỉ thị chất lượng thấp, phần màu xanh cho chất lượng tín hiệu giải trình tự cao. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết giải trình tự, do đoạn đầu và cuối phản ứng giải trình tự không ổn định dẫn tới tín hiệu thấp, khi phản ưng ổn định cường độ tín hiệu cao và chính xác.
30
4.4. Kết quả so sánh, phân tích chỉ thịCOI các mẫu nghiên cứu
4.4.1. Chỉ thị COI của mẫu dê
4.4.1.1. Kết quả so sánh, phân tích cùng loài
Để khẳng định chỉ thị COI đã được khuếch đại là chỉ thị COI của loài
Capra hircus (dê). Chúng tôi tiến hành BLAST trình tự COI của 4 mẫu dê nghiên cứu trên (NCBI). Kết quả được thể hiện đại diện trên hình 4.4.
Hình 4.4: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Capra
hircus đã công bố trên NCBI
Kết quả BLAST cho thấy chỉ thị COI của 4 mẫu dê nghiên cứu có sự tương đồng cao là 99% so với các chỉ thị của loài Capra hircus đã được công bố trên GenBank. Từ kết quả trên cho thấy, 4 chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Capra hircus. Chúng tôi lựa chọn 3 chỉ thị có mã số LS992610.1, LS992606.1 và LS992662.1 để tiến hành các phân tích và đánh giá tiếp theo (hình 4.5).
31
Hình 4.5. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 4 mẫu
32
So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị
COI của loài Capra hircus đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là LS992610.1, LS992606.1 và LS992662.1 bằng phần mềm Bioedit.
Từ hình 4.5 ta thu được vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị
COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mâu đã được công bố trên NCBI được thể hiện qua bảng 4.2.
Bảng 4.2. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI
Vị trí nucleotide Kí hiệu mẫu 13 215 323 556 559 LS992606.1 C C C T A LS992610.1 C C C T A LS992662.1 C T C T A DH1 - C C C C DH2 - T C C C DN1 - C C C C DN2 - T T C C
Từ kết quả thể hiện trên bảng 4.2 và hình 4.5 cho ta thấy chiều dài vùng gen COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu trên ngân hàng gen khoảng 559 đến 663 bp, tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 42,69% đến 43,29% và có 5 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,75%. Như vậy có thể thấy vùng gen COI có sự sai khác về trình tự nucleotide. Sự sai khác này có thể do đột biến mất nucleotide hoặc thay thế nucleotide ở các vị trí khác nhau trong vùng gen COI của các mẫu. Từ đây 4 mẫu dê nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI tiếp tục được phân tích mức độ tương đồng và mức độ sai khác bằng phần mềm MEGAX phiên bản 7.0 (bảng 4.3).
33
Bảng 4.3. Hệ sốtương đồng khi phân tích trình tự gen COI của 4 mẫu dê nghiên cứu với 3 trình tựđã được công bố trên NCBI
Từ bảng hệ số tương đồng trên cho thấy, vùng gen COI có tính bảo thủ rất cao. Hệ số tương đồng giữa 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã công bố trên NCBI dao động từ 99,987-100% và hệ sốsai khác dao động trong khoảng từ 0-0,013%. Hệ sốtương đồng cao nhất giữa 2 mẫu đã được công bố trên NCBI là LS992606.1 và LS992610.1 với 2 mẫu nghiên cứu là DH1 và DN1 là 99,997%. Hệ số tương đồng thấp nhất là 99,987% giữa hai mẫu nghiên cứu là DN1 và DN2.
4.4.1.2. Kết quả so sánh, phân tích khác loài
Để khẳng định chỉ thị COI của 4 mẫu dê đã được khuếch đại chỉ có ở loài Capra hircus. Chúng tôi tiến hành BLAST trình tự COI của 4 mẫu dê nghiên cứu với trình tự của một số loài khác như Gallus gallus, Sus scrofa ,
Bos taurus, Canis familiaris trên (NCBI). Kết quả đại diện thể hiện trên (hình 4.6).
34
Hình 4.6: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Gallus gallus đã công bố trên NCBI
Kết quả BLAST cho thấy chỉ thị COI của 4 mẫu dê nghiên cứu có sự tương đồng thấp chỉ đạt khoảng 80% so với chỉ thị của loài Gallus gallus,
khoảng 91% so với chỉ thị của loài Bos taurus, khoảng 81% so với chỉ thị của loài Canis familiaris và đạt khoảng 82% so với chỉ thị của loài Sus scrofa đã được công bố trên GenBank. Từ kết quả trên cho thấy, 4 chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự chỉ có ở loài Capra hircus mà không có ở bất kỳ một loài nào khác. Như vậy, có thể khẳng định rằng đoạn gen COI của loài
Capra hircus có tính đặc hiệu loài cao và có độ tương đồng thấp khi so sánh với các loài khác. Đặc điểm này hoàn toàn phù hợp với đặc điểm của mã vạch DNA và có thể khẳng định rằng cặp mồi “Primer CF1d, Primer CR1d” chỉ nhân thành công chỉ thịCOI của loài Capra hircus.
4.4.2. Chỉ thị COI của mẫu lợn
35
Để khẳng định chỉ thị COI đã được khuếch đại là chỉ thị COI của Sus scrofa (lợn). Chúng tôi tiến hành BLAST chỉ thịCOI của mẫu nghiên với các chỉ thịCOI của loài Sus scrofađã công bố trên GenBank (NCBI) (hình 4.7).
Hình 4.7: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu L với chỉ thị COI của Sus scrofa
đã công bố trên NCBI
Từ kết quả trong hình 4.7 cho thấy chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao lên tới 100% so với loài Sus scrofa đã được công bố trên NCBI. Kết quả trên cho thấy, trình tự COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Sus scrofa. Sáu chỉ thị có mã số MG250542.1, KC493612.1, EF545573.1, MH319786.1, MG837549.1 và GU135762.1 được lựa chọn để tiến hành các phân tích và đánh giá tiếp theo.
Phân tích sự sai khác di truyền chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu:
So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu với 6 chỉ thị COI
của loài Sus scrofa đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là MG250542.1, KC493612.1, EF545573.1, MH319786.1, MG837549.1 và GU135762.1 bằng phần mềm Bioedit (Hình 4.8). Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thịCOI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI được thể hiện qua (bảng 4.4).
36
Hình 4.8. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu
nghiên cứu với 6 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI
Bảng 4.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI
Vị trí nucleotide Kí hiệu mẫu 41 MG250542.1 T KC493612.1 T EF545573.1 T GU135762.1 T L T MH319786.1 C MG837549.1 C
Từ kết quả thể hiện trên bảng 4.4 và hình 4.8 cho ta thấy chiều dài vùng gen COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu trên ngân hàng gen dài khoảng 224bp,
37
tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 48,02% đến 48,66% và có 1 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,45%. Như vậy có thể thấy vùng gen
COI có sự sai khác về trịnh tự nucleotide, sự sai khác này có thể do đột biến thay thế nucleotide ở các vị trí khác nhau trong vùng gen COI của các mẫu. Từ đây mẫu lợn nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bốtrên NCBI được phân tích mức độ tương đồng và mức độ sai khác bằng phần mềm MEGAX phiên bản 7.0 (bảng 4.5).
Bảng 4.5. Hệ sốtương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 6 trình tựđã được công bố trên NCBI
Từ bảng hệ sốtương đồng trên cho thấy, vùng gen COI có tính bảo thủ rất cao. Hệ số tương đồng giữa 1 mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã công bố trên NCBI dao động từ 99,99-100% và hệ sốsai khác dao động trong khoảng từ 0- 0,01%. Hệ sốtương đồng cao nhât là 100% giữa 4 mẫu đã công bố trên NCBI là EF545573.1, GU135762.1, KC493612.1, MG250542.1 và 1 mẫu nghiên cứu là mẫu L. Hai mẫu có hệ số tương đồng thấp hơn đạt 99,99% so với mẫu nghiên cứu là mẫu MG837549.1 và MH319786.1.
4.4.2.2. Kết quả so sánh, phân tích khác loài
Để khẳng định chỉ thị COI của mẫu L đã được khuếch đại chỉ có ở loài
38
với trình tự của một số loài khác như Gallus gallus, Bos taurus, Canis familiarisđã công bố trên NCBI.
Hình 4.9. Kết quả so sánh khác loài
Kết quả cho thấy không có trình tự khác loài có mức độ tương đồng đáng kểđược tìm thấy trong cơ sở dữ liệu. Điều này có thể do hai lý do: Trình tự quá ngắn hoặc trình tự có mức độ phức tạp thấp (đa số là các nucleotide cùng loại trong trình tự). Tuy nhiên, chiều dài trình tự tra cứu gồm 227 nucleotide vẫn cho kết quả tốt khi so sánh với trình tự cùng loài và các nucleotide không đơn thuần cùng một loại. Vì vậy có thể kết luận trình tự đoạn gen COI của mẫu giải trình tự chỉ có ở loài Sus scrofa mà không có ở bất kỳ một loài nào khác. Như vậy, cặp mồi “Primer CF1l” và “Primer CR1l” đặc hiệu với đoạn gen COI của loài Sus scrofa mà không đặc hiệu cho bất kỳ một trình tự khác loài nào.
4.4.3. Chỉ thị COI của mẫu bò
39
Để khẳng định chỉ thị COI đã được khuếch đại là chỉ thị COI của Bos taurus. Chúng tôi tiến hành BLAST chỉ thị COI của mẫu nghiên với các chỉ thị COI của loài Bos taurus đã công bố trên GenBank (NCBI). Kết quả được thể hiện đại diện trên hình 4.9.
Hình 4.10: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu B với chỉ thị COI của Bos
taurus đã công bố trên NCBI
Từ kết quả trong hình 4.9 cho thấy chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu có độ
tương đồng cao lên tới 99% so với trình tự đã được công bố trên NCBI. Kết quả trên cho thấy chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Bos taurus. Chúng tôi lựa chọn 3 chỉ thị có mã số MG847595.1, KT151961.1 và KT260195.1 trong cơ sở dữ liệu để tiến hành các phân tích và đánh giá tiếp theo.
Phân tích sự sai khác di truyền chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu:
So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị
COI của loài Sus scrofa đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là MG847595.1, KT151961.1 và KT260195.1 bằng phần mềm Bioedit (hình 4.11, bảng 4.5). Kết quả cho thấy chiều dài vùng gen COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu trên ngân hàng gen dài khoảng 240bp, tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 39,09% đến 40,42% và có 2 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,83% . Như vậy có thể thấy vùng gen COI có sự sai khác về trình
40
tự nucleotide, sự sai khác này có thể do đột biến thay thế nucleotide ở các vị trí khác nhau trong vùng gen COI của các mẫu.
Hình 4.11. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu
B nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI
Bảng 4.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI
Vị trí nucleotide Kí hiệu mẫu 3 184 MG847595.1 C C KT151961.1 C C KT260195.1 C C B A T
41
Tiếp tục tiến hành phân tích mức độ tương đồng và mức độ sai khác giữa mẫu bò nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI bằng phần mềm MEGAX phiên bản 7.0 (bảng 4.6)
Bảng 4.7. Hệ sốtương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 3 trình tựđã được công bố trên NCBI
Từ bảng hệ số tương đồng trên cho thấy, vùng gen COI của bòcó tính bảo thủ rất cao. Hệ số tương đồng giữa mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã công bố trên NCBI dao động từ 99,99-100% và hệ số sai khác dao động trong khoảng từ 0-0,01%.
4.4.1.2. Kết quả so sánh, phân tích khác loài
Để khẳng định chỉ thị COI của mẫu B đã được khuếch đại chỉ có ở loài